عنوان

انتقال ژن کیتیناز Trichoderma atroviride به گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum L.) برای افزایش تحمل به بیماری های قارچی

شماره

پ۲۷۰۰۳

زبان متن نوشتاري يا گفتاري و مانند آن

per

عنوان اصلي

انتقال ژن کیتیناز Trichoderma atroviride به گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum L.) برای افزایش تحمل به بیماری های قارچی

نام نخستين پديدآور

وحیده گوگردچی

نام ناشر، پخش کننده و غيره

کشاورزی

تاریخ نشرو بخش و غیره

۱۴۰۱

نام خاص و کميت اثر

۱۴۸ص.

مواد همراه اثر

سی دی

جزئيات پايان نامه و نوع درجه آن

دکتری

نظم درجات

بیوتکنولوژی کشاورزی

زمان اعطا مدرک

۱۴۰۱/۰۵/۱۰

متن يادداشت

گوجه¬فرنگی ( Lycopersicon esculentum L.) یکی از مهم¬ترین سبزی¬های دنیا است که همانند بسياري از محصولات زراعي توليد آن با چالش¬هاي متعددي ازجمله انواع تنش¬هاي زيستي و غيرزيستي همراه است. پوسيدگي اسکلروتينیايي ساقه با عامل قارچي Sclerotinia sclerotiorum يکي از بيماري¬هاي مهم گوجه¬فرنگی محسوب مي¬شود. اين بيماري باعث کاهش عملکرد و کيفيت گوجه¬فرنگی مي¬گردد. از ميان راهکار¬هاي متداول براي کنترل بيماري¬هاي قارچي از جمله استفاده از نهاده¬هاي شيميايي و افزایش مقاومت با روش¬های اصلاح سنتي که اغلب با محدوديت¬هايي روبرو هستند، مهندسي ژنتيک رويکردي مهمی در کنترل بيماري¬هاي گياهي می¬تواند باشد. اين رهيافت امکان انتقال و ادغام ژن¬هاي موثر در توليد پروتئين¬هاي ضد قارچي در گياهان را امکان¬پذير مي-سازد. از ميان پروتئين¬هاي ضد قارچي، پروتئين¬هاي مرتبط با بيماري¬زايي مانند کيتينازها از نظر ايجاد مقاومت در برابر پاتوژن¬هاي قارچي در بسياري از گياهان شناخته شده¬تر هستند. کيتينازها با هيدروليز بيوپليمر کيتين موجود در ديواره ميلسيوم¬هاي قارچي موجب تجزيه ديواره سلولي و متعاقباً مرگ سلول قارچي مي¬گردند. در اين تحقيق به منظور ارتقاء مقاومت عليه بيماري¬هاي قارچي، ژن اندوکيتيناز (chit42) با منشاء Trichoderma atroviride به همراه دامنه اتصال به کيتين با منشاء باکتري (Serratia marsescense) به گوجه‌فرنگی انتقال یافت. ابتدا برای دسترسی به یک روش تکرارپذیر کشت ‌بافت در دو توده کشتیبان و قرمز کم¬رنگ گوجه¬فرنگی با استفاده از ریزنمونه¬های برگ¬لپه وتیمارهای هورمونی مختلف آزمایشی انجام شد. بر اساس نتایج بدست آمده بیشترین میزان باززایی در هر دو توده در تیمار هورمونی 2 میلی¬گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی¬گرم در لیتر IAA بود. محیط کشت MS تکمیل شده با 5/0 میلی¬گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی¬گرم در لیتر IAA بیشترین میانگین ساقه¬زایی و تعداد برگ به ازای هر ریزنمونه را داشت. سرعت رشد و توسعه ریشه در محیط کشت حاوی 2/0 میلی¬گرم در لیتر IAA بیشتر و سریعتر بود. پس از انتخاب توده قرمز کم¬رنگ به عنوان مناسب¬ترین توده از نظر حداکثر درصد باززایی که در توده قرمز کم رنگ بود، عوامل موثر در تراریختی گوجه¬فرنگي از قبیل مدت زمان پیش¬کشت (1، 2، 3 و4روز)، غلظت آگروباکتریوم (1 و 8/0، 6/0، 4/0= OD600nm)، مدت زمان تلقیح (5، 10، 15 و 20 دقیقه)، سطوح مختلف استوسرینگون (0، 100، 150 و 200 میکرومولار) و مدت زمان هم¬کشتی (1، 2، 3 و 4 روز) مورد بررسي قرار گرفت. نتایج نشان داد، پيش¬كشت دو روزه ريز¬نمونه¬ها در تراريختی اثر معنی¬داری داشت. بيشترین ميزان تراریختی در غلظت 6/0OD600nm= حاصل شد. همچنین بیشترین میزان تراریختی در مدت زمان تلقیح 10 دقیقه و مدت زمان هم¬کشتی دو روز حاصل شد. حضور استوسرینگون اثر افزایشی در کارایی تراریختی گوجه¬فرنگی داشت، به طوریکه بیشترین میزان تراریختی در غلظت 150 میکرومولار استوسرینگون حاصل شد. پس از تعیین بهترین شرایط انتقال ژن، ژن کیتیناز 42، تحت سازه بياني واجد ژن کيتينازي شیمری42 (pBISM2) از طريق تراريختي با آگروباکتريوم به گياه گوجه¬فرنگی منتقل شدند. گياهان تراريخت احتمالي جهت ارزيابي اوليه حضور تراژن¬ها، توسط واکنش زنجيره¬اي پليمراز (PCR) وRT-PCR مورد بررسي قرار گرفتند و تکثیر یک قطعه 900 جفت بازی در لاین¬های تراریخت با استفاده از آغازگرهای اختصاصی مشاهده شد. به توده¬هاي تراريخت منتخب اين امکان داده شد تا براي توليد نسل T1 خودبارور شوند. برای مطالعه میزان بیان ژن در گیاهان گوجه¬فرنگی از واکنش Real-time PCR استفاده شد، گیاه غیرتراریخته بیانی را از ژن chit42 شیمری نشان نداد، تجزیه و تحلیل گیاهان تراریخته الگوهای بیان متفاوتی را در رویدادهای تراریخته مستقل نشان داد، لاین T10 بالاترین میزان بیان ژن را نشان داد و پس از آن لاین T14 بیان بالاتری از ژن مذکور را نشان داد، لاین¬های T22، T15 و T11 در رده¬های بعدی قرار داشتند. در مرحله بعد، فعاليت ضد قارچي گياهان تراريخته با بیان بالا، توسط آزمون¬ زيستي تفرق شعاعي بررسي شد. نتایج نشان داد که نمونه¬های تراریختی که دارای میزان بیان ژن بیشتری در آزمون Real-time PCR بودند نسبت به نمونه¬های تراریختی با میزان بیان پایین، میزان بازدارندگی رشد بیشتری در ارتباط با قارچ مذکور نشان دادند و در نتیجه هاله عدم رشد وسیع¬تری را تشكیل دادند. همچنین تفاوت معنی¬داری بین میزان بازدارندگی رشد قارچ در گیاهان تراریخته با نمونه گیاه غیرتراریخت مشاهده شد.بررسی گلخانه¬ای گیاهان تراریخته نشان دهنده تفاوت معنی¬دار بين گياهان تراريخته و غير تراريخته نسبت به قارچ S. sclerotiorum بر اساس اندازه نکروز ايجاد شده تفاوت معني¬داري وجود داشت. نتایج آزمون¬های آماری انجام شده براساس آزمون دانكن میزان مهار رشد قارچ اسكلروتینیا و گسترش میسلیوم¬های آن به صورت معنی¬داری بین گروه¬های تراریختی مورد بررسی متفاوت بود به طوری-که، لاین T10 کمترین میانگین قطر آلودگی را ازخود نشان داد و علائم نکروزگی کمتری در برگ نسبت به بقیه لاین¬های تراریخته داشت. مهار ناحیه آسیب ایجاد شده توسط قارچ اسكلروتینیا در گیاهان تراریخته حاوی ژن کیتیناز شیمری تقریباً 63/1برابر نسبت به مهار ناحیه آسیب ایجاد شده در نمونه گیاهان غیرتراریخت بود که این نسبت با توجه به اندازه و قطر ناحیه آسیب ایجاد شده به-دست آمد. در این پژوهش، آزمون¬های زیستی و گلخانه¬ای آشكار کردند که گیاهان تراریخته حاوی ژن¬های کیتیناز شیمری در مقایسه با گیاهان غیر تراریخته بطور چشمگیر باعث ممانعت رشد قارچ¬ها و کاهش قطر آلودگی قارچ اسكلروتینیا شدند.

متن يادداشت

Tomato (Lycopersicon esculentum L.) is one of the main vegetables in the world which like many other crops, its plantation and production encounters different challenges of both bio and non-bio stresses. Sclerotinia stem rot caused by fungal photogene Sclerotinia sclerotiorum is one of the major diseases of tomato. Among common methods and procedures wildly being practiced to control fungal diseases. Plant breeding methods, genetic engineering technology is proving itself as an important and productive approach to cope with different plant diseases. Application of gene transfer methods through over expression of useful genes in plants can be a promising substitute for chemical control of diseases. Among antifungal proteins, pathogenic related proteins like defensins and chitinases in terms of their capability to increase resistance against fungal pathogens in many plants are better known. Chitinases which via hydrolyzing chitin biopolymer in the wall of fungal mycelia, they cause cell wall degradation which eventually leads to the fungal cell death. In this study, in order to enhance resistance against fungal diseases, endochitinase (chit42) with Trichoderma atroriviride origin along with chitin binding domain with Serratia marsescense. First, the regeneration and plantlet development of two populations (keshtiban and Germez Kamrang) of Lycopersicon esculentum Mill were examined by factorial expriments with completealy randomized design by optimized concentrations of plant growth regulators. According to the results, among 12 different combinations of plant growth regulators, the MS medium complemented with 2 mg L-1 BAP and 0.2 mg L-1 IAA had the maximum percentage of regeneration (84%). The highest stem length and leave number were recorded on MS medium supplemented with 0.5 mg L-1 BAP and 0.2 mg L-1 IAA. Root growth and development rates were higher and faster in culture medium containing 0.2 mg L-1 IAA. After selecting the best and most suitable population in terms of frequency of regeneration (Germez Kamrang population of tomato), the effects of some factors, such as pre-cultivation time, Agrobacterium concentration, inoculation time, acetosyringone concentration and co-cultivation period on the transformation were investigated. The maximum transformation efficiency was obtained at the OD600 = 0.6. Also, the highest transgenic plants were obtained in the 10 minutes of inoculation and 2 days of co-cultivation. The presence of acetosyringone had an increasing effecton the tomato transformation efficiency, and the highest percentage of transformation was obtained at 150 μM of acetosyringone. The chitinase gene was transformed to tomato via Agrobacterium-mediated method, in the form of expression vector containing chimeric chitinase42 (pBISM2). Probable transgenic plants were studied to find primary presence of transgenes by PCR and RT-PCR and the amplification of a 900-bp fragment was observed in transgenic lines using specific primers. Then, the selected transgenic plants harboring chit42 gene were self-pollinated in order to produce T1 generation. The expression of gene expression in tomato plants was evaluated using a Real-time PCR reaction, analysis of transgenic plants showed different expression patterns in independent transgenic events, the T10 line's had the highest rate showed the expression. In the next step, the antifungal activity of the transgenic plants with high expression was investigated by radial diffraction bioassay. The results showed that the transgenic samples that had higher gene expression levels in the Real-time PCR test than the other transgenic samples and non transgenic plants showing a higher growth inhibition rate. Also, a significant difference was observed between the amount of fungal growth inhibition in transgenic plants and non-transgenic plant samples. The results of greenhouse bioassays on transgenic T1 young leaves challenged with S. sclerotiorum revealed that chimeric chitinase expression in transgenic tomato increased resistance against sclerotinia stem rot. Lesion sizes of transgenic tomatoes caused by S. sclerotiorum were significantly reduced compared to non-transgenic tomato plants. The T10 line showed the lowest average diameter of infection and less signs of necrosis were observed in the leaves compared to the rest of the transgenic plants. Inhibition of the damage area caused by Sclerotinia fungus in transgenic plants containing chimeric chitinase gene was approximately 1.63 times (63% more) compared to the inhibition of the damage area caused in non-transgenic plants. In this research, statistical analysis, biological and greenhouse tests revealed that transgenic plants containing chimeric chitinase genes significantly inhibited the growth of fungi and reduced the diameter of Sclerotinia fungus infection compared to non-transgenic plants.

عنوان گونه گون

Transfer of Trichoderma atroviride chitinase gene to tomato (Lycopersicon esculentum L.) for enhancing resistance against fungal diseases

عنصر شناسه اي

‏گوگردچی،

ساير عناصر نام

وحیده

کد نقش

تهيه کننده

عنصر شناسه اي

‏‏دورانی،

عنصر شناسه اي

ولیزاده،

عنصر شناسه اي

‏زمانی،

ساير عناصر نام

ابراهیم

ساير عناصر نام

مصطفی

ساير عناصر نام

محمدرضا

تاريخ

استاد راهنما

تاريخ

استاد راهنما

تاريخ

استاد مشاور

عنصر شناسه اي

‏ تبریز