تولید پروتئین مامبالجین سم مار با استفاده از ناقل ویروسی در گیاهNicotiana benthamiana
عنوان اصلي به زبان ديگر
Production of Mambalgin snake venom protein using plant viral vector in Nicotiana benthamiana
نام نخستين پديدآور
/غفار خضری
وضعیت نشر و پخش و غیره
نام ناشر، پخش کننده و غيره
: کشاورزی
تاریخ نشرو بخش و غیره
، ۱۳۹۹
نام توليد کننده
، میرزائی
مشخصات ظاهری
نام خاص و کميت اثر
۱۲۱ص
یادداشتهای مربوط به نشر، بخش و غیره
متن يادداشت
چاپی - الکترونیکی
یادداشتهای مربوط به پایان نامه ها
جزئيات پايان نامه و نوع درجه آن
دکتری
نظم درجات
بیوتکنولوژی گیاهی
زمان اعطا مدرک
۱۳۹۹/۰۶/۲۴
کسي که مدرک را اعطا کرده
تبریز
یادداشتهای مربوط به خلاصه یا چکیده
متن يادداشت
مامبالجین- ۱پروتئین ۵۷ اسیدآمینهای از زهر مار مامبا میباشد که با مهار کانالهای ASIC در سلولهای عصبی بهعنوان یک ضد درد قوی همانند مورفین شناخته شده و عمل میکند .تحقیقات نشان داده است که کانالهای ASIC علاوه بر تأثیر در فرآیند درک درد، در چرخه سلولی سلولصهای سرطانی نیز موثرند و در تکثیر و رشد آنها نقش دارند، بنابراین مامبالجین- ۱میتواند به عنوان مهارکننده این کانالصها و جلوگیری از تقسیم سلولی بهعنوان یک ضدسرطان بالقوه شناخته شده و کاربرد داشته باشد .در این پژوهش، اقدام به بیان هترولوگوس این پروتئین در گیاه نیکوتیانا بنتامیانا نموده و زیست سنجی مربوط به مامبالجین-) ۱هم به صورت محلول در پروتئین کل و هم به صورت خالص شده (بیان شده در گیاه روی سلول های سرطانی عصبی و سلول های سرطانی پستانی انجام گرفت .در طراحی کاست بیانی این پروتئین به جای اسیدآمینه متیونین انتهای آمینی از توالی نوکلئوتیدی سیگنال پپتید ۲۴ اسیدآمینهصی اندوکیتیناز Q در ابتدای ژن رمزگردان و برای تخلیص پروتئین نوترکیب از گیاه، از توالی رمزگردان هیستگ متصل به انتهای کربوکسیلی در انتهای ژن و قبل از کدون پایان ترجمه استفاده گردید .سپس توالی اسیدآمینهصی حاصل بر اساس کدونهای رایج گیاه نیکوتیانا بنتامیانا به توالی DNA تبدیل شده و بهینه سازیهای لازم از جمله محتوایGC ، شاخص سازگاری کدونی (CAI) و حذف توالیصهای ناپایدارکننده صورت گرفت .پس از خاتمه طراحی، سنتز شیمیایی کاست در ناقل ویروسی PVX از طریق سفارش انجام و سازه نهایی با روش انجماد-ذوب در اگروباکتریوم همسانه سازی شد .اگروباکتریوم حاوی کاست بیانی مامبالجین- ۱و اگروباکتریوم حاوی ژن) P۱۹ ژن سرکوبگر خاموشی (با همدیگر بطور توام طی روش اگرواینفیلتراسیون وارد فضای بین سلولهای گیاه شدند .پس از ۵ روز بیان پپتید مامبالجین- ۱از طریق لکهگذاری وسترن و الایزای رقابتی مورد بررسی قرار گرفت .جهت تخلیص پروتئین نوترکیب تولید شده در گیاه، از ستون کبالت استفاده شد .برای زیستص سنجی فعالیت پروتئین نوترکیب، آزمون MTT برای سیتوتوکسیسیتی هم به صورت محلول در پروتئین محلول کل (TSP) و هم به صورت خالصشده روی سلولهای سرطانی عصبیSY۵Y) - (SHو سلولهای سرطانی پستان (MCF۷) انجام شد .نتایج مربوط به محتوی پروتئینی گیاهان تراریخت شده نشان داد که پروتئینی به وزن ۷/۴ کیلو دالتون در پروتئین استخراجی کل تولید میصگردد .با استفاده از نتایج الایزای رقابتی و محاسبات کمی سازی، بیان پپتید مامبالجین- ۱به میزان ۰/۸۲۵ گرم بر کیلوگرم بافت تر تازه تخمین زده شد .نتایج MTT نشان داد که مامبالجین- ۱دارای اثر سیتوتوکسیک بر سلولهای سرطانی عصبیSY۵Y- SH، اما بر روی سلولهای سرطانی پستان (MCF۷) اثری نداشت .پپتید مامبالجین- ۱در غلظت حدودی ۷/۵ میکروگرم بر میلی لیتر موجب مرگ ۱۰۰ درصدی سلولهای سرطانی عصبیSY۵Y - SHشد .با توجه به نتایج حاصل، علاوه بر تأیید تولید مامبالجین- ۱نوترکیب فعال بیولوژیک در گیاه نیکوتیانا بنتامیانا معلوم گردید که این پروتئین نوترکیب میتواند بهعنوان یک ماده ضدسرطان بالقوه سلولهای عصبی معرفی گردد در صورتیکه قبل از این تنها بهعنوان یک ماده ضد درد شناخته میشد
متن يادداشت
g/ml inhibited 100 of SH-SY5Y cancer cell growth. According to the results, the expression of the biologically active recombinant Mambalgin-1 in the transformed plant leaves was confirmed and Mambalgin-1 can also have anti-cancer (inhibition of ASIC channels) potential along with its already known analgesic effectإ Mambalgin-1 is a 57-amino acid peptide from Mamba snake venom which that is known and acts as a potent analgesic like morphine by inhibiting ASIC channels in nerve cells. Research have shown that ASIC channels are involved in the proliferation and growth of cancer cells in addition to influencing pain perception; therefore, Mambalgin-1 can be a potential anti-cancer by inhibiting these channels. In this study, Mambaljin-1 peptide was expressed in Nicotiana bentamiana plant and the bioassay effects of this peptide on neuronal cancer cells and breast cancer cells were investigated. In this study, the 24 amino acid signal peptide of endocytinase Q were used to compensate for methionine at the amino terminus of the Mambalgin-1 protein and to purify the recombinant peptide, 6-Histag encoding sequence attached to the carboxyl terminus at the end of the gene and before the translation stop codon was used. The resulting amino acid sequence was converted to DNA sequence based on common Nicotiana bentamiana codons, and the necessary optimizations including GC content, codon adaptation index (CAI) and removing destabilizing sequences were performed on it and cloned into PVX viral vector after chemical synthesis. At the end of the design, the chemical synthesis of the cassette in the PVX viral vector was performed by order and the final vector was cloned by freezing-thawing method in agrobacterium. The two cultures of Agrobacterium containing Mambalgin-1 and P19 silencing suppressor genes were co-agroinfiltrated into Nicotiana benthamiana leaves. The production of recombinant Mambalgin-1 was determined by western blotting and compettive ELISA. Purification of recombinant peptide was performed with cobalt column. For biological activity, MTT (3(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) was analyzed for the cytotoxicity recomboinant Mambalgin-1 (TSP and purified) from the transformed plants on nervous (SH-SY5Y) and breast (MCF7) cancer cells. The results showed that the plants harboring open reading frame of Mambalgin-1 showed recombinant 7.4 kDa proteins in the entire plant extract and the amount of recombinant protein was estimated to be about 0.825 g/kg in fresh leaf tissue. In the MTT test, it was found that Mambalgin-1 had cytotoxic effects on SH-SY5Y cancer cells, yet no effects on MCF7 cancer cells were observed. Cell test results showed that the Mambalgin-1 protein in the concentration of 7/5
عنوان اصلی به زبان دیگر
عنوان اصلي به زبان ديگر
Production of Mambalgin snake venom protein using plant viral vector in Nicotiana benthamiana
نام شخص به منزله سر شناسه - (مسئولیت معنوی درجه اول )