پ۲۶۴۳۳
per
نقش Nrf2 و بیوسنتز گلوتاتیون در اثرات گاما-اوريزانول در برابر استرس گرمایی در فيبروبلاست هاي پوست
صفا تابناک
دامپزشکی
۱۴۰۰
۹۰ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
بیوشیمی بالینی
۱۴۰۰/۱۱/۲۷
استرس گرمایی یکی از مهم¬ترین استرسهای محیطی در زندگی انسان و حیوانات است که می¬تواند ار طریق وقایع بیوشیمیایی مختلف موجب تغییر در بیان ژن¬ها و مسیرهای متابولیکی شده و به تولید رادیکال¬های آزاد منجر شود. برخی ترکیبات طبیعی به دلیل داشتن خواص انتی اکسیدانی اثرات محافظت سلولی در برابر آسیبهای اکسیداتیو ناشی از استرس گرمایی دارند. گاما-اوریزانول ماده مؤثره ليپيدي موجود در روغن سبوس برنج است که از نظر خصوصیات آنتی اکسیدانی مشابه توکوفرول هـا است. مشخص شده است كه ترکیبات فعال در سبوس برنج شامل پروآنتوسیانیدین، کاتشین و اوریزانول داراي اثرات محافظت از پوست در برابر پیری هستند. اما اثرات محافظت سلولی گاما-اوریزانول در برابر استرس گرمایی و مکانیسم این اثرات بررسی نشده است. مطالعه حاضر با هدف بررسي اثرات محافظتی گامااوريزانول در برابر استرس گرمایی در فيبروبلاستهاي پوست و بررسی نقش Nrf2 و گلوتاتیون در مکانیسم اثرات آن طراحي شد. در اين مطالعه از سلول¬های فیبروبلاست پوست HFF2 براي بررسي اثرات گاما-اوریزانول بر زنده ماني سلول، توليد راديكال آزاد، سنتز گلوتاتیون و بیان Nrf-2 به دنبال القای استرس گرمایی استفاده شد. پس از کشت سلول¬های فیبروبلاست پوست HFF2 در محیط كشت RPMI در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 و رسیدن سلول¬ها به فاز لگاریتمی در هر چاهک از پلیت 96 خانه تعداد 15000 سلول جایگذاری مي¬شوند. بعد از گذشت 24 ساعت و تعویض محیط با محیط کشت جدید سلولها به 3 گروه (3 تکرار در هر گروه) شامل گروه دمای طبیعی (NC)، گروه دمای بالا (H)، گروه دمای بالا همراه با 100 میکرو گرم در میلی لیتر گامااوريزانول (H1) تقسیم شد. گروه NC در دمای 37 درجه سانتیگراد و گروه های H و H1 در دمای 43 درجه سانتیگراد کشت داده شدند. نمونه گیری پس 12 ساعت تیمار گرمایی انجام شد. برای بررسي زنده¬ماني سلول¬ها از روش MTT، براي بررسی میزان توليد رادیکال¬های آزاد از روش فلوسایتومتری با استفاده از کیت تجاری سنجش ROS، برای بررسی میزان سنتز گلوتاتیون از اندازه گیری میزان گلوتاتیون سلولی و برای بررسي ميزان بيان NRF2 از روش وسترن بلاتينگ استفاده شد. از نرم افزار GraphPad Prism نسخه 9 و آزمون آنالیز واریانس یکطرفه براي مقايسه نتايج آزمون¬هاي مختلف بين گروه¬هاي مورد مطالعه استفاده شد. استرس گرمايي موجب كاهش گلوتاتيون، افزايش توليد راديكال¬هاي آزاد و القاي استرس اكسيداتيو و افزايش بيان Nrf2 در سلول¬هاي فيبروبلاست پوست انسان شد. افزودن گامااوريزانول در غلظت 100 ميكروگرم در ميلي ليتر به محيط كشت سلول¬هاي فيبروبلاست پوست انسان موجب كاهش توليد راديكال¬هاي آزاد، افزايش توليد گلوتاتيون و تعديل فاكتور رونويسي Nrf2 شد. بنابراين گامااوريزانول مي¬تواند تركيب مؤثري براي محافظت از فيبروبلاست¬هاي پوست در برابر آسيب¬هاي اكسيداتيو از جمله استرس گرمايي باشد.
Heat stress is one of the most important environmental stresses in human and animal life that can change the expression of genes and metabolic pathways through various biochemical events and lead to the production of free radicals. Some natural compounds have cellular protective effects against oxidative damage caused by heat stress due to their antioxidant properties. Gamma-oryzanol is the lipid active ingredient in rice bran oil, which is similar to tocopherols in its antioxidant properties. The active ingredients in rice bran, including proanthocyanidins, catechins, and oryzanol, have been shown to have anti-aging effects on the skin. However, the effects of gamma-oryzanol cellular protection against heat stress and the mechanism of these effects have not been investigated. This study aimed to investigate the protective effects of gamma-oryzanol against heat stress in skin fibroblasts and to investigate the role of Nrf2 and glutathione in the mechanism of its effects. In this study, HFF2 skin fibroblasts were used to evaluate the effects of gamma-oryzanol on cell survival, free radical production, glutathione synthesis, and Nrf-2 expression following induction of heat stress. After culturing HFF2 skin fibroblast cells in RPMI culture medium at 37 ° C and 5% CO2 and reaching the logarithmic phase, 15,000 cells are placed in each well of the 96-well plate. After 24 hours and changing the environment with the new culture medium, the cells were divided into 3 groups (3 replications in each group) including a normal temperature group (NC), a high-temperature group (H), a high-temperature group with 100 micrograms per ml of gamma-oryzanol. (H1) was divided. NC group was cultured at 37 ° C and groups H and H1 at 43 ° C. Sampling were performed after 12 hours of heat treatment. To evaluate the viability of cells by MTT method, to evaluate the production of free radicals by flow cytometry method using ROS commercial kit, to evaluate the rate of glutathione synthesis by measuring the amount of cellular glutathione, and to evaluate the expression of NRF2 expression Western blotting was used. For statistical analysis, SPSS software version 22 and one-way analysis of variance were used to compare the results of different tests between the study groups. Heat stress decreased glutathione, increased free radical production and induced oxidative stress, and increased Nrf2 expression in human skin fibroblasts. The addition of gamma-oryzanol at a concentration of 100 μg / ml to human skin fibroblast cell culture medium reduced the production of free radicals, increased glutathione production, and modulated the transcription factor Nrf2. Therefore, gamma-oryzanol can be an effective compound to protect skin fibroblasts from oxidative damage, including heat stress.
Role of Nrf2 and glutathione synthesis in the effects of gamma-oryzanol against heat stress in skin fibroblasts
تابناک،
صفا
تهيه کننده
بساكي،
هميشه كار،
مهدي
حامد
استاد راهنما
استاد راهنما
تبریز
