تنوع ژنتیکی فایتوپلاسماهای مرتبط با درختان میوه هسته دار در استان آذربایجان شرقی با استفاده از نشانگرهای ژنی مختلف به روش MLST (Multilocus Sequence Typing)
لیلا زیرک
کشاورزی
۱۳۹۹
۲۳۰ص.
سی دی
دکتری
بیماری شناسی گیاهی – پروکاریوت های بیماریزای گیاهی
۱۳۹۹/۱۱/۲۷
فایتوپلاسماها عامل ایجاد بیماریهای مختلفی در درختان میوه هسته دار در مناطق مختلف دنیا می باشند. در سالهای اخیر درختان میوه هسته دار شامل انواع درختان بادام، هلو، زردآلو، گیلاس و انواع آلوها با علایم مشکوک به بیماریهای فایتوپلاسمایی در مناطق مختلف استان آذربایجان شرقی مشاهده شدند. برای شناسایی فایتوپلاسماهای مرتبط با درختان میوه هسته دار، از باغات متعددی در شهرستانهای تبریز، مرند، شبستر، جلفا، عجبشیر، ورزقان، کلیبر، خداآفرین و ایلخچی نمونه برداری گردید. استخراج DNA گیاهی از بافتهای رگبرگ و پوست سبز درختان واجد علایم به روش موری و تامسون انجام گرفت. برای تشخیص وجود آلودگی فایتوپلاسمایی، DNA گیاهی برای انجام واکنشهای PCR و Nested PCR با استفاده از پرایمرهای عمومی و اختصاصی فایتوپلاسمایی مورد استفاده قرار گرفت. نتایج Nested PCR با استفاده از پرایمر عمومی NPA2F/NPA2R نشان داد که 4/20 % از تعداد 500 نمونه گیاهی جمع آوری شده، آلوده به بیماریهای فایتوپلاسمایی بودند که در میان 58 نمونه متعلق به بادام، 18 نمونه متعلق به آلو، 14 نمونه متعلق به هلو و یک نمونه متعلق به گیلاس بودند. در هیچکدام از نمونه های زردآلو باند فایتوپلاسمایی در Nested PCR تکثیر نگردید. نتایج Virtual RFLP با استفاده از توالی های bp 1239 بدست آمده از تعدادی از جدایه های فایتوپلاسمایی نشان داد که سه آنزیم برشی MseI، HhaI و HpaII بخوبی قادر به تمایز گونه های مختلف فایتوپلاسماهای درختان میوه هسته دار آذربایجان شرقی از یکدیگر می باشند. برای تعیین هویت فایتوپلاسماهای مرتبط با هسته داران، تعداد 24 قطعه bp 1239 و bp 485 فایتوپلاسمایی تکثیر شده در Nested PCR به روش سنگر تعیین توالی گردید. بر اساس نتایج تعیین توالی ژنهای 16S-23S rRNA و 16S rRNA مشخص گردید که گونه های ʻCa. Phytoplasma asterisʼ، ʻCa. Phytoplasma aurantifoliaʼ و ʻCa. Phytoplasma phoeniciumʼ بر روی درختان بادام، گونه ʻCa. Phytoplasma phoeniciumʼ بر روی درختان هلو، گونه های ʻCa. Phytoplasma asterisʼ و ʻCa. Phytoplasma trifolliʼ بر روی درختان آلو و گونه ʻCa. Phytoplasma asterisʼ بر روی درختان گیلاس در آذربایجان شرقی ایجاد بیماری می نمایند. نهایتاً بمنظور تعیین هویت ژنتیکی ایزوله های فایتوپلاسمای هسته داران در آذربایجان شرقی، یک جدایه ʻCa. Phytoplasma phoeniciumʼ بدست آمده از هلوی شبستر برای انجام مطالعات تعیین توالی نسل جدید (NGS) به روشIllumina sequencing انتخاب گردید. تجزیه و تحلیل توالی ها با استفاده از نرم افزارهای تحت ویندوز انجام گردید و نهایتاً توالی تعدادی از ژنهای فایتوپلاسمایی پیشبینی شده و جایگاه ژنها مشخص گردید.
Absreact:Phytoplsamas are causal agents of many stone fruits diseases around the world. Recently, in stone fruits orchards in East Azerbaijan province stone fruit trees including almond, peach, apricot, cherry and plum trees showing phytoplasma diseases symptoms were observed. For phytoplasmas detection, sampling was performed from symptomatic and asymptomatic trees in orchards located in Tabriz, Marand, Shabestar, Jolfa, Ajabshir, Varzegan, Kaleybar, Khodaafarin and Ilkhchi Counties. Total DNA was extracted from fresh midribs and green bark tissues of symptomatic and asymptomatic trees. For phytoplasmas detection, PCR and Nested PCR analyses using phytoplasma universal and specific primers were done. Nested PCR using primer pair NPA2F/NPA2R indicated that about 20.4 % of all 500 collected samples were infected with phytoplasmas that 58 samples were belonged to almond, 18 samples were belonged to plums, 14 samples were belonged to peach and one samples was belonged to cherry trees. Any apricot samples could not extend phyoplasma band in Nested PCR assays. Virtual RFLP analysis results using 1239 bp rDNA fragments from some stone fruits phytoplasma isolates showed that three restriction enzymes MseI, HhaI and HpaII could differentiated East Azerbaijan stone fruits phytoplasma isolates from each other. For phytoplasma isolates identification, 1239 bp and 485 bp Nested PCR products from 24 phytoplasma isolates were subjected to sanger sequencing. Sequence analyses indicated that ʻCa. Phytoplasma asterisʼ, ʻCa. Phytoplasma aurantifoliaʼ and ʻCa. Phytoplasma phoeniciumʼ were associated with almond trees, ʻCa. Phytoplasma phoeniciumʼ was associated with almond and peach trees, ʻCa. Phytoplasma asterisʼ and ʻCa. Phytoplasma trifolliʼ were associated with plum trees and ʻCa. Phytoplasma asterisʼ was associated with sweet cherry trees. For genetic characterization of East Azerbaijan stone fruit phytoplasma isolates, a ʻCa. Phytoplasma phoeniciumʼ isolate obtained from peach trees in Shabestar was used to Illumina next generation sequencing analyses. NGS analyses process were done using some windows based softwares. Finally, sequences and position of some phytoplasma genes were predicted.
Genetic diversity among phytoplasmas associated with stone fruit trees in East Azerbaijan province using Multilocus sequence typing (MLST) analysis