شماره کتابشناسی ملی
شماره
۱۶۰۴۹پ
زبان اثر
زبان متن نوشتاري يا گفتاري و مانند آن
per
عنوان و نام پديدآور
عنوان اصلي
غربال گری بیوانفورماتیکی ژنوم جهت جداسازی و کلون‌صسازی ژن آنزیم آلفا آمیلاز آرکی در اشرشیا کلی
نام نخستين پديدآور
/محمد احمدپور شمس آباد
وضعیت نشر و پخش و غیره
نام ناشر، پخش کننده و غيره
: علوم طبیعی
تاریخ نشرو بخش و غیره
، ۱۳۹۵
یادداشتهای مربوط به نشر، بخش و غیره
متن يادداشت
چاپی
یادداشتهای مربوط به پایان نامه ها
جزئيات پايان نامه و نوع درجه آن
کارشناسی ارشد
نظم درجات
میکروبیولوژی
زمان اعطا مدرک
۱۳۹۵/۰۶/۱۷
کسي که مدرک را اعطا کرده
تبریز
یادداشتهای مربوط به خلاصه یا چکیده
متن يادداشت
مقدمه :آلفا آمیلاز آنزیم اندو هیدرولازی می‌صباشد که هیدرولیز نشاسته را توسط شکستن پیوندهای آلفا ۱ به ۴ گلیکوزیدیک کاتالیز می‌صنماید .برای تولید آلفا آمیلاز در مقیاس صنعتی از باکتری Bacillus licheniformis به طور وسیع استفاده می‌صشود .آنزیم آلفا آمیلاز این باکتری می‌صتواند نهایتا تا دمای ۹۰ درجه سانتی‌صگراد تحمل و فعالیت داشته باشد .به دلیل اینکه سوبسترای نشاسته در دمای ۱۰۰ درجه سانتی‌صگراد و بالاتر به صورت محلول در می‌صآید، لذا در طول فرآیند هیدرولیز و مایع سازی نشاسته جهت حفظ پایداری و عملکرد آلفا آمیلاز نیاز به اضافه کردن کلسیم می‌صباشد که هزینه‌صی اضافی را در بر می‌صگیرد .لذا امروزه کشف آلفا آمیلاز پایدار در برابر حرارت از منابع دیگر به خصوص آرکی‌صهای گرما دوست افزایش پیدا کرده است .هدف از تحقیق حاظر دست یابی به توالی نوکلئوتیدی کد کننده‌صی آنزیم آلفا آمیلاز آرکی و کلون سازی قطعه‌صی مهندسی شده در وکتور مناسب و انتقال وکتور نوترکیب به داخل میزبان مناسب .مواد و روش‌صها :به منظور غربال گری ژنوم و انتخاب ژن کد کننده ی آنزیم آلفا آمیلاز از منبع آرکی جهت دستکاری و طراحی، توالی نوکلئوتیدی به طول ۱۵۶۱ جفت باز کد کننده‌صی آنزیم آلفا آمیلاز و توالی اسید آمینه ی آن از آرکی Pyrococcus woesei از پایگاه داده ی اولیه NCBI استخراج و توسط برنامه BLAST تحت هم ردیفی قرار گرفت .پیرو نتایج هم ردیفی، توالی نوکلئوتیدی کد کننده‌صی آنزیم آلفا آمیلاز به طول ۱۳۷۷ جفت باز آرکی Pyrococcus yayanosii به دلیل داشتن دمای بهینه‌صی رشد در ۱۰۰ درجه سانتی گراد و ۷pHجهت طراحی سازه ی ژنی کد کننده ی آنزیم آلفا آمیلاز انتخاب گردید .برای اصلاح ژن، توالی سیگنال پپتید به طول ۲۷ اسید آمینه (۸۱ جفت باز (از ابتدایی ژن حذف گردید و کدون شروع (ATG) به اول توالی اضافه شد .جهت کلون توالی طراحی شده در وکتورpET۲۸a ، جایگاه برشی برای آنزیم‌صهای برش دهنده Nde Iو BamH I در ابتدا و انتهای توالی قرار گرفت .توالی مورد نظر جهت کاهش اختلاف تمایل کدون با میزبان E. coli بهینه سازی گردید و توالی نهایی جهت سنتز ارسال شد، توالی سنتز شده در داخل وکتور pBHA تحویل گرفته شد .با استفاده از روش PCR به کمک پرایمرهایpBHA - FوpBHA - Rتوالی طراحی شده تکثیر و جداسازی گردید .محصول PCR به طول۱۵۴۰ جفت باز جهت وارد کردن در وکتور pET۲۸a تحت تیمار با دو آنزیم Nde I و BamH I قرار گرفت و سپس با استفاده از کیت از ژل الکتروفورز استخراج و خالص سازی شد .سپس وکتور pET۲۸a تحت تیمار با دو آنزیم Nde I و BamH I واقع شد و با آنزیم آلکالین فسفاتاز تیمار گردید .در ادامه، بعد از استخراج وکتور برش یافته از ژل، ژن برش یافته توسط آنزیم DNA لیگاز T۴ درون وکتور وارد شد .با استفاده از روش PCR محصول اتصال (Ligation PCR) به کمک پرایمرهایpET۲۸a - FوpET۲۸a - Rصحت واکنش اتصال (Ligation) تائید گردید و محصول PCR به طول ۱۶۲۶ جفت باز روی ژل الکتروفورز رویت شد .وکتور نوترکیب حاصل (PYCHpET۲۸a) درون میزبان E. coli BL۲۱(DE۳) ترانسفورم شد و کلنی‌صهای مثبت با واکنش PCR روی کلنی‌صها به کمک پرایمرpET۲۸a - FوpET۲۸a - Rتائید گردید .یافته‌صها :با بررسی نتایج غربال گری ژنوم توالی نوکلئوتیدی آنزیم آلفا آمیلاز آرکی Pyrococcus yayanosii به طول ۱۳۱۴ جفت باز پس از مهندسی و اصلاحات لازم در وکتور pET۲۸a در سلول E. coli BL۲۱ کلون شد .کلنی‌صهای مثبت حاوی وکتور نوترکیب (PYCHpET۲۸a) توسط روش PCRاز کلنی مورد تائید قرار گرفت .بحث و نتیجه گیری :روش غربال گری بر پایه توالی ژن و سنتز قطعه‌صی مهندسی شده می-تواند مشکل روش‌صهای معمول غربال گری میکروارگانیسم‌صها برپایه کشت میکروارگانیسم و جداسازی ژن کد کننده‌صی آنزیم را رفع نماید .استفاده از پایگاه داده اولیه NCBI و پایگاه‌صهای داده دیگر می‌صتواند شناسایی و استخراج آنزیم آلفا آمیلازهای مقاوم در حرارت بالای جدید از میکروارگانیسم‌صهای غیر قابل کشت و با امکان دسترسی مشکل را مکان پذیر نماید
متن يادداشت
Introduction: Alpha Amylase is Endo-hydrolase that hydrolysis the starch by breaking alpha 1 to 4 bonds to Glycosidic. The bacteria Bacillus licheniformis widely is used for the alpha-amylase production on an industrial scale. Alpha-amylase of the bacteria can eventually tolerate and having activities in temperatures up to 90 C. Because the starch substrate becomes dissolved in temperature of 100 C and above it, so during liquefaction and starch hydrolysis process and to maintain the stability and function of alpha-amylase, calcium should be added which has additional charges. Therefore newly discovery of heat-stable alpha-amylase from other sources especially in the heat-loving archaea has increased. Materials and Method: In this study, the nucleotide sequence encoding the enzyme alpha-amylase with a length 1314 bp was designed and also was synthesized as synthetic. And then cloned in E. coli prokaryotic host, and was confirmed. To screen for gene and selection gene encoding the enzyme amylase of archaea source to manipulate and design, the 1561 bp nucleotide sequence encoding the enzyme amylase be used. And its amino acid sequence of archaea Pyrococcus woesei extract from the primary database NCBI BLAST program and also these sequences were aligned. Following the results of the alignment, the nucleotide sequence encoding the enzyme amylase was selected to length of 1377 bp archaea Pyrococcus yayanosii. This selection was because of the optimal growth temperature of 100 C and pH=7/0 for designing of gene structure encoding the enzyme amylase. For gene modification, signal peptides with a length of 27 amino acid sequence (81 bp) gene was eliminated from the first start codon (ATG) was added to the first sequence. Designed to clone sequences in the vector pET28a, restriction sites for restriction enzymes BamH I, Nde I at the beginning and end of the sequence was. Desired sequence, in order to reduce differences in codon bias with the host E. coli was optimized. The final sequence was sent to synthesis, synthesized sequences were taken within the vector pBHA. Designed sequences with using PCR, with the help of pBHA-F and pBHA-R primers were amplified and isolated. PCR product length of 1540 bp, for inclusion in the vector pET28a with two enzymes Nde I and BamH I was treated and then extracted and purified using gel electrophoresis kit. Then, pET28a vector was treated with enzymes BamH I and Nde I and then was treated with alkaline phosphatase. Then, after extraction of sectioned vector, the sectioned gene by the enzyme T4 DNA ligase was entered into the vector. Using PCR product connection (Ligation PCR) primers pET28a-R and pET28a-F authenticity binding reaction (Ligation) was approved during the 1626 bp PCR product was observed on gel electrophoresis. The resulting recombinant vector (PYCHpET28a) within the host E. coli BL21 (DE3) was transformed and colonies positive was confirmed by PCR reactions on the colonies with the help of primers pET28a-R and pET28a-F. Results: By analyzing of nucleotide sequence screening results of alpha amylase in archaea Pyrococcus yayanosii with 1314 bp length after the engineering and the necessary reforms in pET28a was cloned in E. coli BL21 cells. Positive colonies containing recombinant vector (PYCH pET28a) was confirmed by PCR method from colony. Discussion and Conclusion: Screening method based on gene sequencing and synthesis of engineered piece can eliminate problems of routine screening methods of microorganisms based on cultivation of microorganisms, isolation of the gene encoding the enzyme. Using the primary NCBI database and other databases can facilitate identification and extraction of resistant alpha-amylase enzyme over high new heat from non-arable microorganisms and with difficult access conditions
نام شخص به منزله سر شناسه - (مسئولیت معنوی درجه اول )
مستند نام اشخاص تاييد نشده
احمدپور شمس آباد، محمد
نام شخص - ( مسئولیت معنوی درجه دوم )
مستند نام اشخاص تاييد نشده
زرینی، غلامرضا، استاد راهنما
مستند نام اشخاص تاييد نشده
برزگر، ابوالفضل، استاد مشاور
مستند نام اشخاص تاييد نشده
دهقان، غلامرضا، استاد مشاور
دسترسی و محل الکترونیکی
يادداشت عمومي
سیاه و سفید
وضعیت فهرست نویسی
وضعیت فهرست نویسی
نمایه‌سازی قبلی
