عنوان

شناسایی مولکولی ایزوله‌های فاسیولا و دیکروسلیوم در نشخوارکنندگان استان مرکزی با استفاده از تکنیک PCR- RFLP و HRM

Country Code

IR

Number

۲۱۰۰پ

.Language of Text, Soundtrack etc

فارسی

Country of publication

IR

Title Proper

شناسایی مولکولی ایزوله‌های فاسیولا و دیکروسلیوم در نشخوارکنندگان استان مرکزی با استفاده از تکنیک PCR- RFLP و HRM

General Material Designation

[پایان‌نامه]

Parallel Title Proper

Molecular characterization of Fasciola and Dicrocoelium isolates based on PCR-PFLP and HRM Markazi Province

First Statement of Responsibility

/الناز نظامی

Place of Publication, Distribution, etc.

[بی جا]

Name of Publisher, Distributor, etc.

: پزشکی

Date of Publication, Distribution, etc.

، ۱۳۹۷

Specific Material Designation and Extent of Item

۱۶۲ص.

Text of Note

چاپی - لوح فشرده

Dissertation or thesis details and type of degree

کارشناسی ارشد

Discipline of degree

انگل شناسی پزشکی

Body granting the degree

علوم پزشکی کاشان

Text of Note

سابقه و هدف :فاسیولیازیس و دیکروسلیازیس یکی از بیماری‌های مهم انگلی مشترک بین انسان و دام با گسترش جهانی است و به لحاظ پزشکی، دامپزشکی و اقتصادی دارای اهمیت فراوان است .یکی از عوامل بیماری کبدی جنس فاسیولا و دیکروسلیوم است .ایران جزء مناطق آندمیک بیماری است و از سراسر کشور آلودگی به هر دو گونه فاسیولاصهپاتیکا و فاسیولاصژیگانتیکا و دیکروسلیوم گزارش می‌صشود .دیکروسلیازیس از شایع‌ترین بیماری‌صهای انگلی مجاری صفراوی و کیسه صفرای طیف وسیعی از پستانداران ازجمله نشخوارکنندگان اهلی و گاهی انسان است .عامل ایجادکننده بیماری گونه‌صهای مختلف دیکروسلیوم است که مهم‌صترین آن در ایران وجهان دیکروسلیوم دندریتیکوم می‌صباشد .هدف از انجام این مطالعه تشخیص و شناسایی ایزوله‌های گاو، گوسفند و بز فاسیولا و دیکروسلیوم جمع‌آوری‌شده از کشتارگاه اراک طی سال‌های۱۳۹۵ - ۹۶ با استفاده از چهار روش مرفومتریک، تعیین توالی و HRM،RFLP -PCRمی‌صباشد .مواد و روش‌صها :تحقیق به روش مقطعی (CrossSectional) طراحی شد .بدین منظور در مرحله اول ۶۸۰کرم بالغ دیکروسلیوم و۱۲۰کرم بالغ فاسیولا از کبد گاو، گوسفند و بز) از هر کبد۱ کرم بالغ فاسیولا و۴ کرم بالغ دیکروسلیوم (جمع‌آوری و با استفاده از ۲۵شاخص و نسبت استاندارد مرفومتریک، گونه فاسیولا و ۲۱شاخص گونه دیکروسلیوم شناسایی و مورد آنالیز فنوتیپی قرارگرفت و نتایج با آزمون‌صهای آماریWay ANOVA - OneوTest - Tمورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت .در مرحله دوم ۶۰ ایزوله فاسیولا و ۶۰ایزوله دیکروسلیوم که دارای اختلافات مرفومتریک بودند، انتخاب و با استفاده از کیت، استخراج DNA صورت گرفته و واکنش زنجیره‌ای پلی-مراز (PCR) جهت تکثیر نواحی ژنی میتوکندریائی ND۱ و CO۱ فاسیولا و همچنین ناحیه ND۱دیکروسلیوم انجام گردید .از روشRFLP -PCRو با استفاده ازآنزیم‌صهای محدودالاثر HindIII و Eco۸۸۱الگوی هضم آنزیمی نواحی ND۱ و CO۱ایزوله‌صهای فاسیولا تعیین گردید .سپس DNA ۶۰نمونه فاسیولا برای آنالیز واکنش HRM مورد بررسی قرار گرفت .همچنین DNA ۶ایزوله فاسیولا و ۸ ایزوله دیکروسلیوم تعیین توالی و میزان مشابهت دوبدوی آن‌صها بایکدیگر ودرمقایسه با موارد ثبت شده در بانک ژن با استفاده ازنرم افزار Clustalw۲ محاسبه ودرنهایت درخت فیلوژنتیک ترسیم و مورد تفسیر قرارگرفت .یافته‌صها :طول فاسیولا هپاتیکا برای ایزوله‌های گوسفند ۱/۲تا ۴/۲ سانتیمتر، گاو۹/۲ تا ۳/۳ سانتیمتر و بز ۲/۱تا ۵/۱ سانتیمتر و عرض آن برای ایزوله‌های گوسفند۷/۱تا۹/۱سانتیمتر، بز ۱/۱تا۲/۱سانتیمتر و گاو۲/۱تا۳/۱سانتیمتر تعیین شد .همچنین طول فاسیولا ژیگانتیکا برای ایزوله‌های گوسفند ۸/۴ تا ۰۳/۵ سانتیمتر، گاو۲/۴تا ۰۳/۵ سانتیمتر و بز۵/۴ تا ۹/۴ سانتیمتر و عرض آن برای ایزوله‌های گوسفند۱/۱تا۲/۱سانتیمتر، بز ۹/۰تا۰۳/۱سانتیمتر و گاو۱/۱تا۲/۱سانتیمتر تعیین شد . طول دیکروسلیوم دندریتیکوم برای ایزوله‌صهای گوسفند۶۷/۰ تا۶۹/۰سانتیمتر، بز۶۵/۰ تا ۶۷/۰ سانتیمتر و گاو۹/۰ تا۷/۰سانتیمتر وعرض آن برای ایزوله‌های گاو۱۳/۰ تا۲/۰ سانتیمتر، بز۱۲/۰ تا۱۷/۰ سانتیمتر و گوسفند۱۳/۰ تا۱۷/۰ سانتیمتر تعیین شد .ح در ایزوله‌صهای گاو تمامی شاخص‌صها و نسبت‌صهای مرفومتریک به‌طور معنی‌داری بالاتر از سایر میزبانان می‌صباشد .واکنش PCR طول نواحی ND۱و CO۱فاسیولا را به ترتیب ۷۰۰bp و ۵۰۰bpو طول ناحیه ND۱دیکروسلیوم را ۲۰۰ bp نشان داد .آنالیزRFLP - PCRبا استفاده از آنزیم‌صهای محدودالاثر HindIII و Eco۸۸۱به ترتیب :باندهای۷۳bp، ۱۲۰bp و ۵۰۷bp را برای ناحیه ND۱و باندهای ۴۷bp، ۱۵۳bp و ۳۰۰bp را برای ناحیه CO۱فاسیولا نشان داد .آنالیز HRM ۶۰ نمونه DNA فاسیولا نشان داد، از ۲۰ایزوله گاو، ۸ ایزوله فاسیولا ژیگانتیکا و۱۲ ایزوله فاسیولا هپاتیکا، از ۲۰ایزوله گوسفند، ۷ایزوله فاسیولا ژیگانتیکا و ۱۳ ایزوله فاسیولا هپاتیکا و از ۲۰ ایزوله بز، ۴ ایزوله فاسیولا ژیگانتیکا و ۱۶ ایزوله فاسیولا هپاتیکا بود .آنالیز دوبدوی توالی‌صهای بدست آمده میزان مشابهت ژنتیکی نواحی ژنی CO۱و ND۱ایزوله‌صهای فاسیولا را به ترتیب ۴۲ :تا۱۰۰ درصد و ۲۸/۵۱ تا۱۰۰ درصد و ناحیه ژنی ND۱ دیکروسلیوم را ۹۲/۴۳ تا ۱۰۰درصد نشان داد .نتیجه‌گیری :آنالیز مرفومتریک در شناسایی اولیه دو گونه فاسیولا هپاتیکا از فاسیولا ژیگانتیکا و همچنین دیکروسلیوم دندریتیکوم از سایر گونه‌ها ابزار مناسبی است ولی برای تفکیک و شناسایی دقیق گونه‌صها باید از روشهای مولکولی نیز استفاده گردد .مارکرهای ژنتیکی میتوکندریائی CO۱و ND۱بخوبی قادر به تفکیک گونه‌صهای فاسیولا از یکدیگر و همچنین شناسائی دیکروسلیوم در دام‌صهای کشتارگاهی می‌صباشد . همچنین نشان داده شد، آنالیز HRMتکنیک حساس و قابل اعتمادی برای تفکیک گونه‌صهای جنس فاسیولا ازیکدیگر می‌صباشد .با توجه به محدودیت‌صهای روشRFLP - PCRاستفاده از روش آنالیز HRM جهت تعیین ژنوتایپ‌صهای انگلی توصیه می‌صشود .کلمات کلیدی: مرفومتریک، مولکولی،HRM ،RFLP -PCR، نشخوار کننده، فاسیولا، دیکروسلیوم

Text of Note

.Background: Fascioliasis and Dicrocoeliasis are two important parasitic diseases which are common between human and animals and have global distribution. It is very important in point of medical, veterinary and economy. These diseases are caused by genus of Fasciolidae (Fasciola hepatica and F. gicantica) and Dicrocoelium . Iran is an endemic area and infection of these two trematodes are reported from all over all the country. Dicrocoeliasis is one of the commonest parasitic diseases of the bile ducts and gallbladder in a wide range of mammals including ruminants and sometimes human being. This disease is caused by genus of Dicrocoelium The most important species is D. dendriticum in Iran and the world. In this study, Morphometric, Sequencing, PCR-RFLP, HRM methods have been used to identify cattle, sheep and goat isolates of Fasciola and Dicrocoelium which have been collected in the abattoir of Arak in the central province Iran from Feb 2015 to 2016. Materials and Methods: The present research has been designed as a cross-sectional method. For this purpose, in the first stage, 680 Dicrocoelium and 120 Fasciola adult worms were collected from livers of infected cattle, sheep and goats (from each liver 1 adult Fasciola and 4 adults Dicrocoelium) and analyzed using 25 indices and morphometric standard ratios related to Fasciola and 21 indices of related to Dicrocoelium. The results were analyzed by one-way ANOVA and T-test.In the second stage, 60 Fasciola isolates and 60 Dicrocoelium isolates with morphometric differences were selected and DNA extraction was performed using a kit, and a PCR reaction was performed to amplify the mitochondrial regions of ND1 and CO1 Fasciola, as well as the ND1 region of the dicrocoelium. The PCR-RFLP method using restriction enzymes HindIII and Eco881 were determined by enzyme pattern digestion of ND1 and CO1 genetic regions of Fasciola isolates. Then, DNA of 60 Fasciola specimens was investigated for HRM reaction analysis. DNA of 6 isolates of Fasciola and 8 Dicrocoelium isolates were sequenced and their similarity were calculated comparatively with those recorded in the gene bank using the Clustalw2 software, and finally, the phylogenetic tree was mapped and interpreted

ba

Parallel Title

Molecular characterization of Fasciola and Dicrocoelium isolates based on PCR-PFLP and HRM Markazi Province

نظامی، الناز

Country

ایران

Call Number

پ۲۱۰۰ ،۲۶ ،۱۳۹۷

نمایه‌سازی قبلی

pc

TF

1

a

Y