ساخت و آنالیز ناک-این GFP در رده سلولی K562 حامل جهش های HPFH-type از نوع غیر حذفی
General Material Designation
[پایان نامه]
Parallel Title Proper
Construction and analysis of K562 GFP knock-in cells harboring non-deletional HPHF-type mutations
.PUBLICATION, DISTRIBUTION, ETC
Name of Publisher, Distributor, etc.
علوم بهزیستی و توانبخشی University of Social Welfare and Rehabilitation
Date of Publication, Distribution, etc.
۱۳۹۹
PHYSICAL DESCRIPTION
Specific Material Designation and Extent of Item
۱۴۵ص.
DISSERTATION (THESIS) NOTE
Dissertation or thesis details and type of degree
دکترا
Discipline of degree
ژنتیک پزشکیMedical Genetics
Date of degree
۱۳۹۹/۰۲/۲۹
SUMMARY OR ABSTRACT
Text of Note
هموگلوبینوپاتی ها، نظیر بتا-تالاسمی، از متداول ترین اختلالات ارثی در ایران و جهان هستند که به دلیل اختلال جهش هایی در ژن بتا-گلوبین رخ می دهند. فعال سازی مجدد ژن گاما گلوبین که درطی فرایند تکامل خاموش شده است، سطح هموگلوبین جنینی را بالا می برد و علائم بتا تالاسمی را بهبود می بخشد. تداوم بیان گاما گلوبین جنینی در بزرگسالی به طور طبیعی در یک شرایط ژنتیکی تحت عنوان پایداری ارثی هموگلوبین جنینی (HPFH) رخ می دهد. جهش نقطه ای در پروموتر گاما گلوبین جنینی می تواند باعث HPFH شود. هدف مطالعه حاضر ناک-این یک کاست EGFP در ژن های گاما-گلوبین سلول های K562 از طریق CRISPR / Cas9، و ارزیابی بیان و القاء هدفمند ترانس ژن EGFP بواسطه هیدروکسی اوره (HU) و در ادامه ایجاد جهش های HPFH، -175 T→C، −195 C→G و A→G -113 در ناحیه پروموتر و بررسی تاثیر آنها بر میزان فلئورسنس EGFP بود. در نهایت هدف کلی مطالعه ارائه یک پلت فرم بالقوه برای آزمایش اثر عملکرد ترکیبی از جهش ها یا ایجاد جهش هایی غیر طبیعی در کاست به منظور افزایش بیان گاما-گلوبین است.کاست های EGFP به طور اختصاصی وارد ژن Gγ شده اند. بیان EGFP در جمعیت سلول هدف و کلون های ایزوله شده مشاهده شد. علاوه بر این، رونوشت EGFP و سطوح فلورسانس پس از تیمار با HU به طور قابل توجهی القا شد. در فاز دوم مطالعه و پس از ایجاد جهش های HPFH، -175 T→C، −195 C→G و A→G -113 در ناحیه پروموتر، سطوح فلورسانس در سلول های حاوی جهش -175 T→C افزایش پیدا کرد، درحالی که در رده های سلولی دارای دو جهش دیگر میزان فلئورسنس کاهش یافت.این سیستم برای مطالعات در مقیاس ژنوم عناصر تنظیمی عمل کننده سیس که در بیان گاما-گلوبین یا القاء توسط HU دخالت دارند، به راحتی قابل استفاده است. از سوی دیگر به نظر می رسد جهش -175 T→C نسبت به دو جهش دیگر گزینه درمانی بهتری است.كلمات كليدي: CRISPR / Cas9، آنالیز عملکردی، القای گاما گلوبین، ناک-این
Text of Note
Hemoglobinopathies, such as beta-thalassemia, are of the most common hereditary disorders in Iran and around the world which result from mutations in the adult β-globin gene. Reactivating the developmentally silenced fetal γ-globin gene elevates fetal hemoglobin levels and ameliorates symptoms of beta-thalassemia. The continued expression of fetal γ-globin into adulthood occurs naturally in a genetic condition termed hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH). Point mutations in the fetal γ-globin proximal promoter can cause HPFH.The aim of the present study was To knock-in an EGFP cassette into the c globin genes of K562 cells via CRISPR/Cas9, and to assess expression and hydroxyurea (HU)-mediated induction of the targeted EGFP transgene. Subsequently -175 T→C, -113 A→G and -195 G→C HPFH mutations were introduced into cells using CRISPR/Cas9 and the fluorescence level in cells was evaluated. The EGFP cassettes were specifically knocked into the Gγ gene. EGFP expression was detected in the targeted cell population and isolated clones. Furthermore, EGFP transcript and fluorescence levels were significantly induced following HU treatment. Fluorescence levels of cells increased after the introduction of -175 T → C mutation, whereas fluorescence decreased in the cell lines with the other two mutations.This system is readily utilizable for genome scale studies of cis-acting regulatory elements which are implicated in γ-globin expression or HU mediated induction. On the other hand, it seems that the -175 T → C HPFH mutation is a better therapeutic option that the other two mutations.Keywords: CRISPR / Cas9, Functional Analysis, γ-globin Induction, Knock-In