عنوان

بررسی اثر هم زمان سرکوب ژن B7H6 و داروی داکاربازین در مهار رشد و مهاجرت سلول های سرطانی ملانوما

Number

پ۲۵۵۴۹

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

بررسی اثر هم زمان سرکوب ژن B7H6 و داروی داکاربازین در مهار رشد و مهاجرت سلول های سرطانی ملانوما

First Statement of Responsibility

آلاله محمدی آقباش

Name of Publisher, Distributor, etc.

دامپزشکی

Date of Publication, Distribution, etc.

۱۴۰۰

Specific Material Designation and Extent of Item

۱۰۱ص.

Accompanying Material

سی دی

Dissertation or thesis details and type of degree

دکتری

Discipline of degree

دامپزشکی

Date of degree

۱۴۰۰/۰۸/۱۹

Text of Note

مقدمه: ملانوما یک سرطان بسیار تهاجمی با قابلیت متاستاز بالا به اندام های داخلی مانند سیستم لنفاوی، ریه و کبد بوده که میزان بروز ان در حال افزایش است. مولکول های ایست بازرسی ایمنی، مولکول هایی حیاتی هستند که عملکرد سلول های T را با فعال کردن یا مهار آن، تنظیم می کنند. در میان این مولکول های پروتئینی، پروتئین های متمایز خانواده B7 تقش مهمی را در فرار ایمنی سلول های توموری ایفا می کنند و می توانند با اتصال به گیرنده بازدارنده، ایمنی ناشی از سلول T را سرکوب کنند. پروتئین های خانواده B7 در مراحل مختلف تشکیل ریز محیط تومور یافت شده و باعث ایجاد و پیشرفت تومور می گردند. ژن B7H6 (NCR3LG1)، یک عضو جدید از خانواده B7، به دلیل خواص ایمونوژنیک منحصر به فرد و نظارت بر ایمنی سلول های NK ناشی از اتصال به گیرنده ان (NKp30) شناخته شده است. این ژن تحریک کننده در انواع خاصی از تومورها از جمله گلیوما ، سرطان سینه ، تومورهای بدخیم هماتولوژیک به میزان بسیار زیادی بیان شده در سلول های سالم (به استثنای موارد تحریک التهابی یا میکروبی) بسیار کم بیان شده و یا اصلا بیانی ندارد. کمپلکس پروتئینی B7H6-NKp30 بر روی غشای سلول های توموری منجر به فعال شدن سلول های NK و آزادسازی فاکتور نکروز دهنده تومور و اینترفرون گاما می شود. درمان قدیمی و رایج ملانومای جلدی، جراحی و استفاده از داروهای شیمی درمانی می باشد. داروی داکاربازین به عنوان داروی انتخابی شیمی درمانی در برابر این سرطان استفاده می شود. این دارو سبب متلیه کردن اسیدهای نوکلئیک و اسیب به DNA شده و در نهایت منجر به توقف رشد و مرگ سلولی می شود اما عوارض جانبی این دارو در برابر مزیت های آن یک چالش جهت تجویز این دارو می باشد. هدف اصلی در این مطالعه، بررسی اثر ترکیبی B7H6-siRNA و داروی داکاربازین در القای آپوپتوز ، مهار رشد ، مهاجرت سلولی ، تشکیل کلونی و همچنین تاثیر ان بر ژن های دخیل در این مسیر ها از جمله : Sox2 ، Bax ، Bcl-2 ، Caspase-3 ، MMP2 ، MMP3 ، MMP9 ، CD44 وNanog می باشد.مواد و روش‌ها: برای تعیین تاثیر ترکیبی siRNA و داروی داکاربازین بر رده سلولی ملانوما (A375)، ابتدا تست MTT برای سنجش میزان زنده مانی ، حساسیت سلول ها و همچنین IC50 داروی داکاربازین انجام شد. برای بررسی میزان بیان ژن B7H6 و ژن های مورد مطالعه، قبل و بعد از انجام ترنسفکشن توسط B7H6-siRNA در سلول های ملانوما ، تکنیک qRT-PCR به کار گرفته شد. از تکنیک های Wound healing، MTT assay ، Colony formation assay به منظور بررسی میزان مهاجرت، تکثیر و تقسیم سلول‌های سرطانی و میزان زنده مانی آن‌ها و نیز تعداد کلونی‌های تشکیل شده بعد از ترنسفکشن-siRNA B7H6 به تنهایی و همراه با داروی داکاربازین استفاده گردید. از آنجایی که سرکوب ژن B7H6باعث القای آپوپتوز می شود؛ از طریق رنگ آمیزی Annexin V-FITC/PI و DAPI میزان آپوپتوز القا شده و توقف چرخه سلولی به روش فلوسایتومتری اندازه گیری شد.یافته‌ها: این مطالعه نشان داد که میزان بیان ژن B7H6 درسلول های A375 با انتقال B7H6-siRNA وابسته به دوز و زمان کاهش یافته است. میزانIC50 داروی داکاربازین با استفاده از تست MTT درگروه تیمار شده با دارو 70/32 میکرومولار بدست امد، اما در گروه ترکیبی این عدد به 94/19 میکرومولار کاهش پیدا کرد که بیانگر کاهش مقدار دوز موثر داروی داکاربازین می باشد. سرکوب ژن B7H6 توسط B7H6-siRNA و داروی داکاربازین منجر به کاهش زنده مانی، رشد، تکثیر سلول های سرطانی، مهاجرت و تعداد کلونی های تشکیل یافته شد و همچنین سبب افزایش میزان اپوپتوز و توقف چرخه رشد سلولی درفاز S گردید. نتیجه گیری: نتایج به دست آمده از این مطالعه نشان داد که سرکوب ژن B7H6 می تواند باعث کاهش مهاجرت و متاستاز رده سلولی A375 گردد که این سرکوب در صورت همراه شدن با داکاربازین تاثیر بیشتری بر القای فرایند آپوپتوز، کاهش رشد و تکثیر سلول های سرطانی ملانوما و کاهش متاستاز از طریق کاهش یا افزایش بیان ژن های دخیل در این مسیر ها خواهد گذاشت. همچنین استقاده از درمان ترکیبی می تواند باعث کاهش دوز موثر دارو و کاهش عوارض جانبی گردد. از این یافته ها می توان استنباط کردکه مهار B7H6 همراه با داکاربازین می تواند به عنوان یک رویکرد درمانی ارزشمند جهت درمان بیماران مبتلا به ملانوما مد نظر گرفته شود.

Text of Note

AbstractIntroduction: Melanoma is a highly invasive cancer with a high potential for metastasis to internal organs such as the lymphatic system, lungs, and liver, which is on the rise. Immunosuppression molecules are vital molecules that regulate the function of T cells by activating or inhibiting them. Among these protein molecules, distinct B7 proteins play an important role in the immune escape of tumor cells and can suppress T cell-induced immunity by binding to the inhibitory receptor. B7 family proteins are found in different stages of the tumor microenvironment and cause tumor formation and progression. The B7H6 gene (NCR3LG1), a new member of the B7 family, is known for its unique immunogenic properties and immunosurveillance of NK cells induced by its receptor binding (NKp30). This co-stimulatory gene is highly expressed in certain types of tumors, including gliomas, breast cancer, and hematologic malignancies but, is very little or not expressed in healthy cells (except inflammatory or microbial stimulation conditions). The B7H6-NKp30 complex on tumor cell membranes activates NK cells and releases tumor necrosis factor and interferon-γ. The oldest and most common treatment for cutaneous melanoma is surgery and the use of chemotherapy drugs. Dacarbazine is used as the choice chemotherapy drug for this cancer. It inhibits nucleic acids and damages DNA, eventually leading to stunted growth and cell death. But the side effects of this drug versus its benefits are a challenge for prescribing this drug. The purpose of this study was to evaluate the combination of B7H6-siRNA and dacarbazine effect on induction of apoptosis, growth inhibition, cell migration, colony formation, and also effect on genes involved in these pathways including Sox2, Bax, Bcl-2, Caspase-3, MMP2, MMP3, MMP9, CD44, and Nanog.Materials and methods: To determine the combination of siRNA and dacarbazine effect on melanoma cell line (A375), MTT assay was performed to measure the viability, cell sensitivity, and IC50 of dacarbazine. The qRT-PCR was used to evaluate the expression of the B7H6 gene and the studied genes before and after transfection by B7H6-siRNA in melanoma cells. Wound healing assay, MTT assay, colony formation assay was used to evaluate the rate of migration, proliferation, division, and survival of cancer cells, as well as the number of colonies formed after transfection-siRNA B7H6 alone and with Dacarbazine. Induced apoptosis and cell cycle arrest were measured by Annexin V-FITC / PI and DAPI staining by flow cytometry.Results: This study demonstrated that the expression of the B7H6 gene in A375 cells decreased with dose and time-dependent B7H6-siRNA transfer. The IC50 of Dacarbazine drug was obtained using the MTT assay in the drug-treated group of 32.70 μM, but in the combination group, this number decreased to 19.94 μM, which indicates a decrease in the effective dose of Dacarbazine. Suppression of the B7H6 gene by B7H6-siRNA and dacarbazine decreased survival, growth, cell proliferation, migration, and the number of colonies formation, as well as increased apoptosis and arrested of the S-phase cell cycle.Conclusion: The results of this study illustrated that suppression of the B7H6 gene can reduce migration and metastasis of the A375 cell line, which if combined with dacarbazine has a greater effect on inducing apoptosis. Reducing the cell growth and proliferation of melanoma cancer cells and reducing Metastasis will result in decreased or increased expression of genes involved in these pathways. Also, the use of combination therapy can reduce the effective dose of the drug and decrease side effects. From these findings, it can be concluded that inhibition of B7H6 with dacarbazine can be considered a valuable therapeutic approach for the treatment of patients with melanoma.

Variant Title

The Effect of Simultaneous B7H6 Gene Suppression and Dacarbazine on Inhibition of Melanoma Cancer Cell Growth and Migration

Entry Element

‏محمدی آقباش،‏

Part of Name Other than Entry Element

آلاله ‏

Relator Code

تهيه کننده

Entry Element

‏فیروزامندی‏،

Entry Element

‏برادران،

Entry Element

‏مرادی،

Part of Name Other than Entry Element

معصومه ‏

Part of Name Other than Entry Element

بهزاد ‏

Part of Name Other than Entry Element

معصومه ‏

Dates

استاد راهنما

Dates

استاد مشاور

Dates

استاد مشاور

Entry Element

تبریز