عنوان

عوامل مؤثر در کالوس زایی، کشت سلولی و تراریختی چند رقم برنج ایرانی

Number

پ۲۶۱۸۷

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

عوامل مؤثر در کالوس زایی، کشت سلولی و تراریختی چند رقم برنج ایرانی

First Statement of Responsibility

منصور فرخنده طالع ناوی

Name of Publisher, Distributor, etc.

کشاورزی

Date of Publication, Distribution, etc.

۱۴۰۰

Specific Material Designation and Extent of Item

۱۰۷ص.

Accompanying Material

سی دی

Dissertation or thesis details and type of degree

دکتری

Discipline of degree

بیوتکنولوژی کشاورزی

Date of degree

۱۴۰۰/۱۰/۲۰

Text of Note

برنج (Oryza sativa L.) از مهّم‌ترین غلات جهان محسوب شده و نیمی از جمعیت جهان از آن جهت تغذیه استفاده می¬کنند. برنج به عنوان یک میزبان مناسب به ویژه از طریق کشت سوسپانسیون سلولی به عنوان یک میزبان گیاهی ایمن، کارآمد و مقرون به صرفه از نظر اقتصادی را در جهت تولید پروتئین¬های نوترکیب فراهم می¬کند. در این پژوهش، اثر غلظت¬های مختلف 2,4-D (0/0، 0/1، 5/1 و 0/2 میلی¬گرم در لیتر) روی فرآیند کالوس¬زایی 10 رقم برنج بومی منطقه شمال ایران و همچنین رشد سوسپانسیون سلولی رقم¬های منتخب در تیمارهای مختلف و میزان تراریختی آنها مورد مطالعه قرار گرفت. آزمایش اوّل به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. نتایج آزمایش اول نشان داد که بین غلظت¬های مختلف هورمون 2,4-D و همچنین بین ارقام مختلف برنج از نظر کالوس¬زایی و میانگین وزن تر کالوس¬ها اختلاف معنی¬داری وجود دارد. محیط کشت MS حاوی 2 میلی¬گرم در لیتر 2,4-D بیشترین درصد کالوس¬زایی (%33/79) را در بین ارقام مختلف برنج نشان داد و ارقام هاشمی و بینام با مقدار %67/86 بیشترین درصد کالوس¬زایی را دارد و کمترین درصد کالوس¬زایی مربوط به ارقام گوهر و حسنی (%33/63) است. علاوه بر این، در غلظت 2 میلی¬گرم در لیتر از تنظیم کننده¬ رشد گیاهی 2,4-D، حداکثر و حداقل میانگین وزن تر کالوس به ترتیب در ارقام هاشمی (09/7 ± 33/374 میلی¬گرم) و شفق (55/6 ± 00/192 میلی¬گرم) مشاهده شد. آزمایش دوّم، کشت سوسپانسیون سلولی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد، که به منظور بررسی کشت سوسپانسیون سلولی، حدود 500 میلی¬گرم از کالوس¬های ترد و خرد شونده سه رقم ذکر شده به طور جداگانه به محیط کشت پایه MS مایع حاوی 2 میلی¬گرم در لیتر 2,4-D، غلظت¬های مختلف کاینتین (0/0، 1 و 2 میلی¬گرم در لیتر) و غلظت¬های مختلفی از ساکارز (30 و 60 گرم در لیتر) منتقل شدند. از نظر میزان رشد سلولی (وزن تر و خشک و حجم توده سلولی)، اختلاف معنی¬داری بین ارقام مختلف برنج و همچنین بین غلظت¬های مختلف کاینتین و ساکارز وجود دارد. محیط کشت حاوی 2 میلی گرم در لیتر کاینتین و 60 گرم در لیتر ساکارز بیشترین میزان رشد سلولی را نشان داد و بالاترین میانگین وزن تازه سلولی در رقم هاشمی مقدار 97/3 گرم است. براساس نتایج به دست آمده از آزمایش¬های کالوس¬زایی و کشت سوسپانسیون سلولی، سه رقم برتر شامل هاشمی، بینام و کاظمی انتخاب و جهت بهینه¬سازی عوامل موثر بر کارایی تراریختی به کمک آگروباکتریوم مورد استفاده قرار گرفتند. در آزمایش سوم بخش اوّل به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار که اثرات متقابل ژنوتیپ گیاهی (ارقام هاشمی، بینام و کاظمی)، سویه باکتریایی (AGL-1، EHA105 و LBA4404) بررسی شد. در آزمایش سوم، بخش دوم در قالب طرح آزمایشی کاملا تصادفی با سه تکرار بطور مستقل برای بررسی اثر غلظت های مختلف باکتریایی (1/0، 3/0 و 6/0)OD600، همچنین در آزمایش سوم، بخش سوم در قالب طرح آزمایشی کاملا تصادفی با سه تکرار بطور مستقل برای بررسی غلظت استوسیرینگون (µM 50، 100 و 200) و همچنین در آزمایش سوم، بخش چهارم در قالب طرح آزمایشی کاملا تصادفی با سه تکرار بطور مستقل برای بررسی مدت زمان هم¬کشتی (1، 2 و 3 روز) بر اساس درصد کالوس¬های مقاوم به هیگرومایسین مورد ارزیابی قرار گرفتند. پلاسمید مورد استفاده جهت تراریختی در این پژوهش ناقل دوگانه pCAMBIA1304 بوده که حامل ژن گزینشگر hpt و ژن گزارشگر gusA بود. بیشترین میزان تراریختی در رقم هاشمی تلقیح شده با سویه (3/0 OD600) EHA105 در محیط گزینش حاوی 100 میکرو مولار استوسیرینگون و هم¬کشتی به مدت 2 روز مشاهده شد. همچنین، بررسی¬های مولکولی با استفاده از PCR، RT-PCR و درج ژن gusA درون ژنوم میزبان را در کالوس¬های تراریخته تایید کردند. علاوه بر این، آزمون هیستوشیمیایی GUS فعالیت آنزیم β-گلوکورونیداز درون بافت کالوس رقم هاشمی تلقیح شده با سویه¬های مختلف اگروباکتریوم را نشان داد.

Text of Note

AbstractRice (Oryza sativa L.) as one of the most important cereals is a vital food item in the world. Nearly half of the world's population depends on rice as a staple food. Rice is also used as a safe, efficient and economically viable platform to produce recombinant proteins especially through cell suspension culture. In this research, effect of different concentrations of 2,4-D (0.0, 1.0, 1.5, and 2.0 mg/L) was investigated for callus induction efficiency of 10 varieties of native rice in the northern region of Iran. There was a significant difference between different concentrations of 2,4-D and cultivars in response to callus production and callus fresh weight. The highest callogenesis (79.33%) was obtained in 2,4-D 2.0 mg/L and the highest and lowest callogenesis was observed in Hashemi and Binam (86.67%) and Gohar and Hasani (63.33%) varieties, respectively. In 2,4-D 2.0 mg/L, Hashemi and Shafagh varieties showed maximum and minimum callus fresh weights with amounts 374.33 ± 7.09 and 192.00 ± 6.55 mg, respectively. Among the cultivars studied, four varieties Hashemi, Binam, Kazemi, and Domsiah were selected and tested for establishment of cell suspension cultures. The fragile calli (500 mg) from four varieties were separately transferred to MS liquid medium supplemented with 2,4-D (2.0 mg/L), kinetin (0.0, 1.0, 2.0 mg/L), and sucrose (30 and 60 g/L). A significant difference was observed in cell growth quantities between different varieties as well as in kinetin and sucrose levels. The MS medium supplemented with 2.0 mg/L kinetin and 60.0 g/L sucrose exhibited the maximum cells growth in all genotypes and the highest cell fresh weight was observed in Hashemi (3.97 g). Based on the obtained results from callogenesis and cell suspension culture, the varieties Hashemi, Binam, and Kazemi were selected and applied to optimize factors affecting the Agrobacterium-mediated transformation efficiency. The factors affecting the transformation efficiency, including genotype (Hashemi, Binam, and Kazemi), bacterial strain (AGL-1, EHA105, and LBA4404), bacterial density (OD600 0.1, 0.3, and 0.6), acetosyringone concentration (50, 100, and 200 µM), and co-cultivation period (1, 2, and 3 days) were evaluated via determination of the frequency of hygromycin-resistant calli. The pCAMBIA1304 binary vector having the hpt and gusA genes was used to investigate the transgenic calli. Higher efficiency of genetic transformation were observed in Hashemi inoculated with EHA105 (OD600 0.3) at 100 μM AS and 2 days of co-culture time. In addition, insertion of the gusA gene into host genomes and the gusA transcript expression in transgenic calli were confirmed by PCR and RT-PCR, respectively. Moreover, the β-glucuronidase activity was proved in Hashemi cultivar inoculated with different Agrobacterium strains by GUS histochemical assay.

Variant Title

Factors affecting the callus induction, cell culture and transformation of some Iranian rice varieties

Entry Element

‏فرخنده طالع ناوی،

Part of Name Other than Entry Element

‏منصور

Relator Code

تهيه کننده

Entry Element

‏دورانی،

Entry Element

حدّاد

Entry Element

عبادی،

Part of Name Other than Entry Element

‏ابراهیم

Part of Name Other than Entry Element

‏ رحیم

Part of Name Other than Entry Element

‏علی اکبر

Dates

استاد راهنما

Dates

استاد مشاور

Dates

استاد مشاور

Entry Element

‏ تبریز