عنوان

تولید پروتئین نوترکیب اینترفرون گامای انسانی در توتون,‮‭Production of recombinant human interferon- in tobacco‬

Number

‭۲۲۹۴۷پ‬

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

تولید پروتئین نوترکیب اینترفرون گامای انسانی در توتون

Parallel Title Proper

‮‭Production of recombinant human interferon- in tobacco‬

First Statement of Responsibility

/رضا حیدری جاپلقی

Name of Publisher, Distributor, etc.

: کشاورزی

Date of Publication, Distribution, etc.

، ‮‭۱۳۹۸‬

Name of Manufacturer

، میرزائی

Specific Material Designation and Extent of Item

‮‭۲۶۲‬ص‬

Text of Note

چاپی - الکترونیکی

Dissertation or thesis details and type of degree

دکتری

Discipline of degree

بیوتکنولوژی کشاورزی

Date of degree

‮‭۱۳۹۸/۱۱/۱۳‬

Body granting the degree

تبریز

Text of Note

در این پژوهش، پروتئین اینترفرون گامای انسانی‮‭(hIFN‬ - (با استفاده از سیستم‌صهای بیانی مختلف شامل سیستم بیانی باکتریایی ‮‭(Escherichia coli)‬ و سیستم‌صهای بیانی دایم و گذرا در توتون تولید و میزان بیان آن در این سیستم‌صها مورد مقایسه قرار گرفت .علاوه بر این، اثر توالی پلی‌صپپتید شبه الاستین ‮‭(ELP)‬ و هدف‌صگیری به مکان‌صهای مختلف سلولی) در سیستم‌صهای بیانی دایم و گذرا (روی میزان تولید پروتئین نوترکیب بررسی شد .در باکتری‮‭E. coli‬ ، پروتئین ممزوج‮‭ELP -- hIFN‬در مقایسه با پروتئین‮‭hIFN‬ - آزاد با سطوح بالایی از عملکرد و به شکل نسبتا محلول تولید شد .میزان عملکرد پروتئین نوترکیب‮‭hIFN‬ - پس از اتصال به توالی ‮‭ELP‬ حدود ‮‭۱۰‬ برابر افزایش یافت و به میزان ‮‭۸۵/۴۶‬ از پروتئین کل محلول ‮‭(TSP)‬ رسید .همچنین، با استفاده از خالص‌صسازی به روش چرخه انتقال معکوس‮‭(ITC)‬ ، پروتئین ممزوج‮‭ELP -- hIFN‬با میزان خلوص ‮‭۲‬ ▒ ‮‭۹۷‬ به طور کارآمدی بازیابی شد .میزان بیان گذرای پروتئین نوترکیب‮‭hIFN‬ - در ارقام ‮‭Samsun‬ و ‮‭Xanthi‬ توتون ‮‭(Nicotiana tabacum)‬ و گونه ‮‭N. benthamiana‬ تلقیح شده با سویه‌صهای مختلف‮‭Agrobacterium tumefaciens (EHA۱۰۵‬ ، ‮‭GV۳۱۰۱‬ و ‮‭LBA۴۴۰۴)‬ حامل ناقل‌صهای بیانی مختلف با استفاده از واکنش‮‭time PCR - Real‬کمی‮‭PCR) - (qRT‬و آزمون الایزا مورد بررسی قرار گرفت .بیشترین میزان بیان گذرا در برگ‌صهای رقم ‮‭Samsun‬ تیمار شده با سویه ‮‭GV۳۱۰۱‬ و با هدف‌صگیری به درون شبکه آندوپلاسمی یا فضای آپوپلاستی مشاهده شد .مشابه با سیستم بیانی باکتریایی، اتصال توالی ‮‭ELP‬ به‮‭hIFN‬ -، میزان انباشت پروتئین نوترکیب را به میزان ‮‭۶/۲‬ برابر ‮‭( ۴۸/۲۲ TSP)‬ افزایش داد و با استفاده از روش‮‭ITC‬ ، موجب بازیابی کارآمد پروتئین نوترکیب‮‭hIFN‬ - با خلوص ‮‭۱‬ ▒ ‮‭۹۸‬ شد .کارایی تراریختی به کمک اگروباکتری در توتون با بررسی عوامل موثر بر انتقال ژن از قبیل ژنوتیپ گیاهی، سویه باکتریایی و نوع روش تراریختی از طریق فرآیند جنین‌صزایی سوماتیکی مستقیم مورد مطالعه قرار گرفت .ریزنمونه‌صهای برگی ارقام مختلف توتون با استفاده از سویه‌صهای اگروباکتری حامل ناقل دوگانه ‮‭pCAMBIA۱۳۰۴‬ از طریق سه روش متفاوت تراریختی شامل‮‭inoculation- Agro‬،‮‭infection - Agro‬و‮‭injection - Agro‬تلقیح شدند .بیشترین میزان کارایی تراریختی در رقم ‮‭Xanthi‬ تلقیح شده با سویه ‮‭LBA۴۴۰۴‬ و با استفاده از روش تراریختی‮‭infection - Agro‬به دست آمد .به این ترتیب، از رقم‮‭Xanthi‬ ، سویه ‮‭LBA۴۴۰۴‬ و روش‮‭infection - Agro‬جهت انتقال ژن‮‭hIFN‬ - به توتون استفاده و شش گروه مختلف از گیاهان تراریخته تولید شد .گیاهان تراریخته با استفاده از روش‌صهای لکه‌صگذاری سادرن،‮‭PCR- RT‬،‮‭PCR- qRT‬، لکه‌صگذاری نوردرن، آزمون الایزا و لکه‌صگذاری وسترن مورد بررسی قرار گرفته و به این ترتیب بیان رونوشت و تولید پروتئین نوترکیب‮‭hIFN‬ - در گیاهان تراریخته تایید شد .بررسی‌صها نشان داد که گیاهان تراریخته از گروه‌صهای مختلف از نظر میزان بیان رونوشت ژن‮‭hIFN‬ - اختلاف معنی‌صداری با یکدیگر ندارند، اما از نظر میزان بیان پروتئین نوترکیب، اختلاف معنی‌صداری بین گیاهان تراریخته مشاهده شد .میزان تولید پروتئین ممزوج‮‭ELP -- hIFN‬در مقایسه با پروتئین‮‭hIFN‬ - آزاد حدود ‮‭۲/۴‬ برابر بیشتر بوده و تقریبا ‮‭۰۵/۴‬ از ‮‭TSP‬ را تشکیل داد .بررسی گلیکوزیلاسیون نشان داد که پروتئین ممزوج‮‭ELP -- hIFN‬و پروتئین‮‭hIFN‬ - آزاد در مکان‌صهای مختلف سلولی گلیکوزیله شده و حداکثر مقدار تولید آن‌صها از طریق هدف‌صگیری به درون شبکه آندوپلاسمی به دست می‌صآید .تعداد نسخه‌صهای ژن‮‭hIFN‬ - در گیاهان تراریخته از گروه‌صهای مختلف با استفاده از روش‮‭PCR - qRT‬نیز مورد بررسی قرار گرفت .مشابه با لکه‌صگذاری سادرن، برآورد نسبتا دقیقی از تعداد نسخه‌صهای ژن‮‭hIFN‬ - تحت شرایط بهینه‮‭PCR - qRT‬در گیاهان تراریخته ‮‭T۰‬ به دست آمد .علاوه بر این، مقایسه برآورد تعداد نسخه‌صهای ژن‌صهای‮‭hIFN‬ - و ‮‭hpt‬ نشان داد که یک بازآرایی‮‭DNA - T‬در تعدادی از گیاهان تراریخته رخ داده است .همچنین، بررسی فعالیت ضد ویروسی نشان داد که پروتئین‌صهای نوترکیب به شکل ممزوج یا آزاد تولید شده در سیستم‌صهای بیانی مختلف، می-توانند از سلول‌صهای ‮‭Vero‬ در برابر آلودگی ویروس ورم مخاط دهانی ‮‭(VSV)‬ تحت شرایط درون‌صشیشه محافظت کنند

Text of Note

1 by ITC. The Agrobacterium-mediated transformation efficincy of tobacco was tested with investigation of factors influencing gene delivery, including genotype of the plant, bacterial strain, and Agrobacterium transformation procedure via direct somatic embryogenesis. The leaf explants of the all three genotypes were transformed by three Agrobacterium strains harboring the binary vector pCAMBIA1304 using three different types of transformation methods as named Agro-inoculation, Agro-infection and Agro-injection. The highest transformation rate was obtained in Xanthi cultivar transformed with the strain LBA4404 by Agro-infection method. The Xanthi cultivar, strain LBA4404 and Agro-infection were thus applied to transfer hIFN- gene to tobacco and therefore different six transformed lines were generated. Using southern blot, RT-PCR, qRT-PCR, northern blot, ELISA, and western blot techniques, expression of hIFN- transcript and production of recombinant hIFN- protein were confirmed in transformed tobacco plants. The amount of hIFN- transcript did not vary significantly among the different transgenic plants, but there was a significant difference in the levels of recombinant hIFN- protein among various events. In contrast to corresponding unfused hIFN- protein, production amount of the hIFN--ELP increased by 4.2-fold with a high expression at an average of 4.05 of TSP. Analysis of glycosylation revealed that fused or unfused hIFN- proteins are glycosylated in different cellular locations and their higher levels of yield were obtained via targeting to the ER. The copy numbers of hIFN- in the genome of the transgenic tobacco plants were also determined by qRT-PCR. Similar to southern blot, the relatively exact estimates of copy numbers of hIFN- were obtained in the T0 transformants under optimized qRT-PCR conditions. Moreover, the copy number estimates of both the hIFN- transgene and the hpt gene indicated that a T-DNA rearrangement was happened in some transgenic tobacco plants. As well, anti-viral bioassay demonstrated that recombinant hIFN- and hIFN--ELP proteins were able to protect Vero cells from infection caused by Vesicular Stomatitis Virus (VSV) in vitro ▒ 2 . Level of transient hIFN- expression was evaluated in different genotypes of Nicotiana tabacum L. cvs. Samsun, and Xanthi, and N. benthamiana infiltrated with various Agrobacterium tumefaciens strains (EHA105, GV3101, and LBA4404) carrying various expression constructs using quantitative real time-PCR (qRT-PCR) and ELISA. The highest level of transient hIFN- expression was observed in leaves of Samsun cultivar infiltrated with the strain GV3101 and with targeting the hIFN- protein to endoplasmic reticulum (ER) or apoplastic space. Similar to E. coli, the ELP fusion increased the accumulation of hIFN- by 2.6-fold (22.48 of TSP) and effectively recovered it with an overall purity of the 98 ▒ In this research, the human IFN gamma (hIFN-) protein was produced using various expression systems including bacterial cells (Escherichia coli) and tobacco in transient or stable and its yield level was compared in these expression systems. In addition, the effects of elastin-like polypeptide (ELP) tag and targeting to different cellular locations on accumulation of recombinant hIFN- protein were analyzed in transient or stable expression system. In E. coli, hIFN--ELP fusion protein was relatively produced in the form of soluble and accumulated with high level of yield, compared with the corresponding unfused hIFN- protein. The fusion to ELP signicantly increased the accumulation of hIFN- by 10-fold with a stable expression about 46.85 of total soluble protein (TSP). Furthermore, the Inverse Transition Cycling (ITC) recovered efficiently the hIFN--ELP and increased its overall purity of to 97

Parallel Title

‮‭Production of recombinant human interferon- in tobacco‬

حیدری جاپلقی، رضا

Heidari-Japelaghi, Reza

ولیزاده، مصطفی، استاد راهنما

حداد، رحیم، استاد راهنما

دورانی، ابراهیم، استاد مشاور

جواران، مختار جلالی، استاد مشاور

Public note

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی