عنوان

بیان پروتئین غیر فعال کننده ریبوزوم ‮‭Ebulin I‬ از گیاه آقطی در اشریشیاکولی,‮‭Expression of Ebulin I ribosome inactivating protein of sambucus in Escherichia coli‬

Number

‭۲۲۷۸۶پ‬

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

بیان پروتئین غیر فعال کننده ریبوزوم ‮‭Ebulin I‬ از گیاه آقطی در اشریشیاکولی

Parallel Title Proper

‮‭Expression of Ebulin I ribosome inactivating protein of sambucus in Escherichia coli‬

First Statement of Responsibility

/معصومه رضایی مشایی

Name of Publisher, Distributor, etc.

: کشاورزی

Date of Publication, Distribution, etc.

، ‮‭۱۳۹۸‬

Name of Manufacturer

، میرزائی

Specific Material Designation and Extent of Item

‮‭۱۶۳‬ص‬

Text of Note

چاپی - الکترونیکی

Dissertation or thesis details and type of degree

دکتری

Discipline of degree

بیوتکنولوژی کشاورزی گیاهی

Date of degree

‮‭۱۳۹۹/۰۲/۱۵‬

Body granting the degree

تبریز

Text of Note

پروتئین‌صهای غیرفعال کننده ریبوزوم یا ‮‭RIP‬صها توکسین‌صهایی با فعالیت‮‭N‬ -گلیکوزیدازی روی ‮‭rRNA‬ ریبوزوم‌های پستانداران، قارچ‌صها، گیاهان، جلبک‌ها و باکتری‌صها می‌صباشند که بطور برگشت ناپذیری طویل سازی زنجیره پلی پپتیدی را متوقف کرده و سبب بازدارندگی سنتز پروتئین می‌شوند .گیاه آقطی (.‮‭(Sambucus ebulus L‬ از گونه‌صهای ارزشمند و دارویی شمال ایران است که به‌دلیل دارا بودن ترکیب پیچیده ای از انواع ‮‭RIP‬ها و لکتین‌صهای مرتبط، یک مدل گیاهی مناسب برای بررسی این پروتئین‌ها می-باشد .اولین ‮‭RIP‬ نوع ‮‭II‬ جداسازی شده از برگ‌صهای گیاه آقطی، ‮‭Ebulin I‬ می‌صباشد که فعالیت بازدارندگی شدیدی روی سنتز پروتئین پستانداران نشان داده است اما مانع سنتز پروتئین گیاهان و باکتری‌صها نمی‌صشود و همین امر همسانه‌سازی و بیان آن را در سیستم‌صهای باکتریایی و گیاهی امکان پذیر می‌سازد .در تحقیق حاضر به منظور جداسازی ژن ‮‭Ebulin I‬ از گیاه‮‭Sambucus ebulus‬ ، آغازگرهای دژنره بر اساس توالی‌های ثبت شده در پایگاه‮‭NCBI‬ طراحی شدند .توالی نوکلئوتیدی ژن ‮‭Ebulin I‬جداسازی و در ناقل‮‭+۲۸a(- pET‬ (همسانه‌سازی شد، سپس به باکتری ‮‭E. coli‬ سویه ‮‭DH۵‬ انتقال یافت .بعد از توالی یابی ژن و تایید صحت قطعه مورد نظر، ناقل نوترکیب)‮‭Ebulin I -)+ pET۲۸‬به منظور بیان پروتئین مذکور به سویه ‮‭BL۲۱(DE۳)‬ باکتری ‮‭E. coli‬ منتقل شد .پس از تایید مولکولی محصولات همسانه‌صسازی شده از طریق ‮‭colony PCR‬ و هضم آنزیمی، به منظور بررسی بیان در سطح ترجمه، آنالیزهای‮‭PAGE - SDS‬و‮‭Western blot‬ انجام شد .نتایج‮‭PAGE - SDS‬نشان داد که پروتئین مذکور بیشتر به فرم نامحلول و به‌میزان کمتری به فرم محلول بیان می‌شود .به‌منظور افزایش بیان پروتئین نوترکیب به فرم محلول از بیان همزمان پروتئین هدف با پلاسمید چاپرونی‮‭Tf۲ - pG‬و کاهش دمای رشد پس از القاء برای افزایش حلالیت و عملکرد پروتئین استفاده شد .در نهایت پروتئین نوترکیب با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی خالص‌صسازی و فعالیت‌صهای ضدزیستی پروتئین تخلیص‌شده مورد بررسی قرار گرفت .نتایج آزمایش بررسی لخته شدن خون نشان داد که این پروتئین دارای فعالیت لخته شدن خون بوده و درحداقل غلظت ‮‭۵۰‬ میکروگرم در میلی‌لیتر سلول‌های قرمز خون را لخته می‌کند .بررسی اثرات ضدقارچی نشان داد که انکوبه‌کردن این پروتئین با اسپورهای دو گونه از قارچ‌های پاتوژن گیاهی مانع از جوانه‌زنی اسپورهای قارچ پس از گذشت ‮‭۲۴‬ ساعت می‌شود .نتایج بررسی فعالیت ضدتوموری نیز نشان داد که این پروتئین دارای اثر کشندگی وابسته به دوز و زمان روی رده سلول‌های سرطانی ‮‭MCF۷‬ و ‮‭HT۲۹‬ بوده و درصد زنده‌مانی با افزایش غلظت ‮‭Ebulin I‬ کاهش می‌یابد .باتوجه به یافته‌های بدست آمده می‌توان پیشنهاد کرد که ‮‭Ebulin I‬ نوترکیب، ممکن است پتانسیل بالایی برای توسعه گیاهان تراریخته مقاوم به پاتوژن‌ها داشته باشد و می‌توان آن را به‌عنوان کاندیدی برای محافظت از عوامل بیماری‌زا در نظر گرفت .سمیت سلولی پروتئین مذکور نیز، آن را یک ماده آنتی‌توموری بالقوه بویژه برای تولید ایمونوتوکسین‌های مبتنی بر ‮‭RIP‬ می‌سازد

Text of Note

g/ml concentration. Antifungal effects showed that incubation of this protein with spores of two species of plant pathogenic fungi prevented the germination of fungal spores after 24 h. The results of antitumor activity assay also showed that this protein had a dose- and time-dependent lethal effects on MCF7 and HT29 cancer cell lines and decreased survival percent by increasing Ebulin I concentration. Based on the findings, it can be suggested that recombinant Ebulin I may have a high potential for the development of pathogen-resistant transgenic products and can be considered as a candidate for disease protection. The protein's cytotoxicity also makes it a potential antitumor material, especially for the development of RIP-based immunotoxinsإ Ribosome-inactivating proteins (RIPs) are toxins with N-glycosidase activity on the rRNA of mammalian, fungal, plant, algae and bacterial ribosomes that irreversibly arrests polypeptide chain elongation and inhibits protein synthesis. Sambucus ebulus L. (Dwarf elder) is one of the medicinal and valuable species of the North of Iran which because of having a complex mixture of diverse types of RIPs and related lectins, It is a suitable plant model for studying these proteins. The first RIP isolated from leaves of dwarf elder was ebulin l, which exhibits great inhibitory activity on mammalian protein synthesis but l does not inhibit protein synthesis in plants and bacteria and this enables cloning and expression in bacterial and plant systems. In this study, to isolate of the Ebulin I gene of Sambucus ebulus, degenerate primers were designed according to the deposited RIP gene sequences in GenBank, NCBI. The nucleotide sequence of the Ebulin I gene was isolated and cloned into pET-28a(+) vector, then was transferred to the DH5 strain of E. coli . After gene sequencing and verification of the desired fragment, the pET28(+)-ebulin1 recombinant vector was transfected to the BL21 of E. coli to express the protein. After molecular confirmation of the cloned products by colony PCR and enzymatic digestion, SDS-PAGE and Western blot analyzes were performed to evaluate translational expression. SDS-PAGE results showed that the ebulin l protein was more expressed in an insoluble form and less in soluble form. Therefore, in order to increase the expression of recombinant protein in soluble form, co-expression of the target protein with pG-Tf2 chaperone plasmid and reduction of growth temperature after induction were used to increase protein solubility and function. Finally, the recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity purification and the anti-biological activities of the purified protein were examined. The results of the hemagglutination assay showed that this protein agglutinated red blood cells at 50

Parallel Title

‮‭Expression of Ebulin I ribosome inactivating protein of sambucus in Escherichia coli‬

رضایی مشایی، معصومه

Rezaei Moshaei, Masoumeh

بنده حق، علی، استاد راهنما

دهستانی، علی، استاد راهنما

پاکدین پاریزی، علی، استاد مشاور

گلگار، مجید، استاد مشاور

Public note

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی