عنوان

بیان و تخلیص پروتئین کالپروتکتین ‮‭(S۱۰۰A۹/S۱۰۰A۸)‬و مطالعه اثرات آن بر مسیرهای سیگنالی‮‭MAP‬ کیناز و آپاپتوزیس در رده سلولی سرطان معده‮‭AGS‬,‮‭Expression and purification of calprotectin (S۱۰۰A۸/S۱۰۰A۹) and study of it's effects on MAP kinase and apoptosis signaling pathways in AGS gastric cancer cell line‬

Number

‭۲۲۵۴۶پ‬

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

بیان و تخلیص پروتئین کالپروتکتین ‮‭(S۱۰۰A۹/S۱۰۰A۸)‬و مطالعه اثرات آن بر مسیرهای سیگنالی‮‭MAP‬ کیناز و آپاپتوزیس در رده سلولی سرطان معده‮‭AGS‬

Parallel Title Proper

‮‭Expression and purification of calprotectin (S۱۰۰A۸/S۱۰۰A۹) and study of it's effects on MAP kinase and apoptosis signaling pathways in AGS gastric cancer cell line‬

First Statement of Responsibility

/فاطمه شعبانی

Name of Publisher, Distributor, etc.

: علوم طبیعی

Date of Publication, Distribution, etc.

، ‮‭۱۳۹۸‬

Name of Manufacturer

، راشدی

Specific Material Designation and Extent of Item

‮‭۱۴۱‬ص‬

Text of Note

چاپی - الکترونیکی

Dissertation or thesis details and type of degree

دکتری

Discipline of degree

زیست شناسی بیوشیمی

Date of degree

‮‭۱۳۹۸/۱۱/۱۹‬

Body granting the degree

تبریز

Text of Note

کالپروتکتین یک پروتئین هترودایمر است و دارای دو زیر واحد ‮‭S۱۰۰A۸‬ و ‮‭S۱۰۰A۹‬ می باشد که از اعضای خانواده پروتئینی سیتوپلاسمی ‮‭S۱۰۰‬ هستند و دارای دمین‮‭hand - EF‬با قابلیت اتصال به کلسیم می باشند .این پروتئین در فاگوسیت هایی مانند نوتروفیل ها بیان می شود و توسط فاگوسیت های فعال شده ترشح می گردد .کالپروتکتین پروتئینی کلیدی بین سرطان و التهاب می باشد .در شرایط طبیعی، غلظت کالپروتکتین در سرم انسانی کمتر از ‮‭g/ml‬ ‮‭۱‬ می باشد درحالیکه در بیمای های التهابی و انواع سرطان افزایش می یابد .بنابراین این پروتئین می تواند بعنوان یک فاکتور تشخیصی قوی مورد توجه قرار گیرد .از آنجاییکه سلول های سرطان دارای مکانیسمهای گوناگونی هستند که آنها را در برابر مرگ سلولی مقاوم می کند، بنابراین آپاپتوزیس بعنوان یک استراژی موثر در کنترل و درمان سرطان شناخته شده است .هدف از این مطالعه بررسی اثرات کالپروتکتین نوترکیب انسانی بر سلول های آدنوکارسینومای ‮‭AGS‬ است که شایع ترین نوع سرطان معده می باشد .وکتور بیانی ‮‭pET۱۵b‬ دارای بخش کدکننده پروتئین های ‮‭S۱۰۰A۸‬ و ‮‭S۱۰۰A۹‬ برای بیان پروتئین های نوترکیب دارای‮‭tag - His‬در باکتری های ‮‭Escherichia coli BL۲۱ (DE۳)‬ بعنوان سلول های میزبان استفاده شد .ترانسفرماسیون به روش شوک حرارت / ‮‭CaCl۲‬انجام شد .آمپی سیلین نیز بعنوان فاکتور انتخابی استفاده شد و یک تک کلنی از کلنی های باکتری ترانسفرم شده در حضور‮‭IPTG‬ ، بعنوان محرک بیان پروتئین، کشت داده شد .سلولها جمع آوری شده و با سونیکاتور لیز گشتند .تخلیص پروتئین های نوترکیب دارای‮‭tag - His‬با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی‮‭NTA - Ni‬و ایمیدازول انجام شد .ایمیدازول بوسیله دیالیز از محیط خارج شد و پروتئین بر روی‮‭PAGE - SDS‬مشاهده شد .سلولهای آدنوکارسینومای معده ‮‭(AGS)‬ در معرض غلظت های مختلف کالپروتکتین نوترکیب انسانی‮‭g/mL) ۱۲۵ - (۵‬به مدت‮‭۲۴‬ ، ‮‭۴۸‬ و ‮‭۷۲‬ ساعت قرار داده شد تا اثر سمیت کالپروتکتین با استفاده از روش های‮‭assay - MTT‬و فلوسایتومتری ‮‭Annexin V/PI‬ و ‮‭Cell Cycle‬ بررسی شود .علاوه بر آن تکنیک های ‮‭real time PCR‬و وسترن بلات برای ارزیابی بیان ژنهای‮‭Bax‬ ، ‮‭Bcl۲‬ و ‮‭MAPK۱ (ERK۲)‬ و سطح پروتئین آنها در سلولهای ‮‭AGS‬ تیمار داده شده با کالپروتکتین استفاده شد .سطح فرم فعال پروتئین ‮‭ERK‬ یا ‮‭ERK‬ فسفریله نیز بررسی شد .نتایح حاصل از‮‭assay - MTT‬و فلوسایتومتری ‮‭Annexin V/PI‬ نشان داد که کالپروتکتین طی رفتاری وابسته به غلظت و زمان دارای اثر مهاری بر تکثیر سلولهای سرطانی است و موجب کاهش حیات و القای آپاپتوزیس در سلولهای ‮‭AGS‬ می گردد .با توجه به یافته های ما از تکنیک‮‭Real time PCR‬، افزایش محسوسی در نسبت بیان ‮‭Bax/Bcl۲‬ دیده شد بنابراین ما می توانیم بگوییم القای آپاپتوزیس توسط کالپروتکتین با کاهش بیان ‮‭Bcl۲‬ و افزایش بیان ‮‭Bax‬ همراه است .نتایج کمی حاصل از آنالیزهای وسترن بلات نیز نسبت تغییر یافته ‮‭Bax/Bcl۲‬ در سلولهای سرطانی تیمار یافته نسبت به سلول های کنترل را تایید کرد .بنابراین نسبت تغییر یافته اعضای آنتی آپاپتوتیک و پروآپاپتوتیک خانواده پروتئینی ‮‭Bcl۲‬ می تواند گزینه کلیدی در درک مکانیسم اثر کالپروتکتین بر سلول های سرطانی باشد .نتایج ما همچنین نشان می دهد که کالپروتکتین موجب افزایش بیان ‮‭ERK۲‬ در غلظت های پایین تر از ‮‭g/ml ۷۵‬می گردد در حالیکه این افزایش بیان در دو غلظت بالاتر، ‮‭g/ml ۱۰۰‬و ‮‭g/ml ۱۲۵‬، متوقف می گردد .سطوح پروتینی ‮‭ERK۲‬ نیز در غلظت های ‮‭IC۵۰‬ کالپروتکتین افزایش اندکی نشان می دهد درحالیکه سطح پروتئین‮‭ERK - phosphor‬کاهش بسیار محسوسی نشان می دهد .رویهمرفته کالپروتکتین در غلظتهای پایین موجب افزایش تکثیر سلولی می گردد در حالیکه در غلظتهای بالاتر تکثیر سلولی را مهار کرده و موجب القای آپاپتوزیس می گردد .القای آپاپتوزیس نیز با تنظیم پروتئین های خانواده ‮‭Bcl۲‬ همراه است .نتایج ما چشم انداز مهمی در مکانیسم مولکولی القای آپاپتوزیس توسط کالپروتکتین فراهم کرده است و می توان گفت کالپروتکتین موجب القای آپاپتوزیس داخل سلولی یا میتوکندریایی می گردد

Text of Note

Calprotectin is a heterodimeric protein consisting of S100A8 and S100A9 subunits which are members of the S100 subfamily of cytoplasmic EF-hand Ca2+-binding proteins. It expressed by phagocytes like neutrophils and secreted from activated phagocytes. Calprotectin is a key protein between cancer and inflammation. In the normal conditions, the concentration of calprotectin in human serum is less than 1 g/ml, which increase in inflammatory disease and different type of cancer such as gastric cancer. It is suggested that calprotectin can be considered as a significant marker for diagnostic purposes. Since the cancer cells have developed various mechanisms to resist cell death so apoptosis is known as an efficient strategy for control and treatment of cancer. The aim of this study was to evaluate the effects of recombinant human calprotectin (rhS100A8/A9) in the adenocarcinoma AGS, the most common type of gastric cancer cell line. The expression vectors of pET15b containing the coding region of S100A8 and S100A9 were used to express the His-tagged fusion proteins in Escherichia coli BL21 (DE3) as host cell. Transformations were performed using CaCl2/ heat shock method. Ampicillin was utilized as the selective marker and a single colony of transformed bacterial colonies was cultured in an IPTG-inducible expression medium. Cells were harvested and lysed by sonication. The purification of recombinant His-Tagged proteins were performed using Ni-NTA affinity chromatography and imidazole. Imidazole was subsequently removed by dialysis and purified proteins were observed with the SDSPAGE. The gastric adenocarcinoma (AGS) cells were exposed to the different concentrations (5-125 g/mL) of recombinant human calprotectin for 24, 48 and 72 hours to evaluate the cytotoxicity effect of calprotectin using MTT-assay, Flow cytometry and Cell Cycle analysis. Furthermore, real-time PCR and western blot were performed for evaluation of the Bax, Bcl2 and MAPK1 (ERK2) genes expression and proteins level in AGS treated with and without calprotectin. The levels of activated form of ERK, phospho-ERK was investigated too. the results of MTT-assay and flow cytometry Annexin V/PI double staining show that this protein has an inhibitory effect on the cancer cells proliferation in an incubation time- and calprotectin concentration-dependent manner and reduced viability and induced apoptosis in AGS cell lines. Considering our finding from real time PCR technique, a significantly increase in Bax/ Bcl2 genes expression ratio has been seen and we can say induction of apoptosis by calprotectin was achieved by down-regulation of Bcl2 and up-regulation of Bax. The quantified data from Western blot analysis confirmed the altered ratio of Bcl2/Bax in treated cells compared untreated cells too. Therefore, altered ratio of pro-apoptotic and anti-apoptotic Bcl2 family members might be an important key to understand the sensitizing effect of calprotectin on cancer cells. Our findings revealed that calprotectin up-regulated the expression of ERK2 in low concentration (less than 75 g/ml) while this up-regulating was stopped in two last considerations, 100 and 125 g/ml. in IC50 concentration treatment, the levels of ERK has increased somewhat while the levels of phospho-ERK was reduced dramatically. Overall, calprotectin induces proliferation at low concentration whereas inhibits proliferation and induces apoptosis in higher concentration by regulating of Bcl2 family Our results provide an important insight into the molecular mechanisms of S100A8/A9-inducing apoptotic and we can say calprotectin might trigger the intrinsic or mitochondrial pathway of apoptosis

Parallel Title

‮‭Expression and purification of calprotectin (S۱۰۰A۸/S۱۰۰A۹) and study of it's effects on MAP kinase and apoptosis signaling pathways in AGS gastric cancer cell line‬

شعبانی، فاطمه

Shabani, Fatemeh

مهدوی، مجید، استاد راهنما

غیبی، نعمت اله، استاد راهنما

حسین پورفیضی، محمدعلی، استاد مشاور

ایمانی، مهدی، استاد مشاور

Public note

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی