عنوان

جداسازی و شناسایی ژن ‮‭PAP‬ از گیاه ‮‭Phytolacca americana‬ در ایران,‮‭Isolation and identification of PAP gene from Phytolacca americana in Iran‬

Number

‭۲۱۳۸۳پ‬

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

جداسازی و شناسایی ژن ‮‭PAP‬ از گیاه ‮‭Phytolacca americana‬ در ایران

Parallel Title Proper

‮‭Isolation and identification of PAP gene from Phytolacca americana in Iran‬

First Statement of Responsibility

/اعظم محبی ملکی

Name of Publisher, Distributor, etc.

: کشاورزی

Date of Publication, Distribution, etc.

، ‮‭۱۳۹۸‬

Name of Manufacturer

، میرزائی

Specific Material Designation and Extent of Item

‮‭۱۱۴‬ص‬

Text of Note

چاپی - الکترونیکی

Dissertation or thesis details and type of degree

کارشناسی ارشد

Discipline of degree

گیاه‌پزشکی - بیماری‌شناسی گیاهی

Date of degree

‮‭۱۳۹۸/۰۴/۲۶‬

Body granting the degree

تبریز

Text of Note

ویروس‌ها سالانه خسارت زیادی به محصولات کشاورزی وارد می‌کنند .با این حال ترکیب شیمیایی برای مدیریت ویروس‌های گیاهی وجود ندارد .طی سال‌های اخیر استفاده از عصاره برخی گیاهان که دارای پروتئین‌های ضد ویروسی جهت کنترل بیماری‌های ویروسی هستند، مورد توجه قرار گرفته است .از جمله پروتئین‌های دارای خاصیت ضدویروسی، پروتئین گیاه سرخاب ‮‭Phytolacca americana (Pokeweed antiviral protein/ PAP)‬ می‌باشد ‮‭PAP‬ .نوعی پروتئین ممانعت کنند ریبوزوم ‮‭(RIP)‬ است که نقش مهمی در مکانیسم دفاعی گیاه در برابر ویروس‌ها دارد ‮‭PAP‬ .روی‮‭dsRNA‬ ها اثر مخرب دارد و از آن‌جایی که اکثر ویروس‌های گیاهی‮‭RNA‬ دار هستند و دارای ژنوم ‮‭dsRNA‬ بوده یا در تکثیرشان ‮‭dsRNA‬ تولید می‌کنند، می‌تواند در کنترل بیماری‌های ویروسی کاربرد داشته باشد .پروتئین‌های غیرفعال کننده ریبوزوم از سرخاب شامل‮‭I- PAP‬،‮‭II- PAP‬،‮‭III - PAP‬و‮‭PAP‬ - ‮‭S‬می‌باشند که ایزوفرم هایی از ‮‭PAP‬ هستند و از برگ‌های بهاری، برگ‌های اوایل تابستان، برگ‌های اواخر تابستان و بذر گیاه سرخاب جداسازی شده‌اند .هدف از انجام این تحقیق، جداسازی و شناسایی ژن‮‭PAP‬ - ‮‭I‬از گیاه) ‮‭Phytolacca americana‬ سرخاب (در ایران می‌باشد .بدین منظور، در این مطالعه پس از تکثیر قطعه ژنی ‮‭PAP‬ با پرایمرهای اختصاصی به روش‮‭PCR‬ ، بررسی برشی آنزیمی با آنزیم‌های محدودالاثر مناسب از جمله‮‭EcoRI‬ ،‮‭Eco۳۲۱‬،‮‭AluI‬ ، ‮‭SalI‬ و ‮‭SacI‬ انجام گرفت تا به این ترتیب تنوع الگوی برشی ژن نمونه مورد مطالعه مشخص شود .هم‌چنین، الگوی برشی نمونه‌های بومی با الگوی برشی داده‌های هم قطار ثبت شده در ژن‌بانک نیز مورد مقایسه قرار گرفت تا تفاوت بین نمونه‌های ایرانی و نمونه‌های از پیش ثبت شده از سایر کشورها معلوم شود .پس از دست‌یابی به الگوی برشی، جهت همسانه‌سازی ژن‮‭PAP‬ ، محصول ‮‭PCR‬ به پلاسمید‮‭pTG۱۹‬ - ‮‭T‬اتصال داده شد و پس از اتصال، پلاسمید نوترکیب به باکتری ‮‭E.coli‬ سویه ‮‭DH۵‬ ترانسفرم گردید .باکتری‌های ترانسفرم شده بر روی محیط کشت ‮‭LB‬ جامد حاوی آمپی‌سیلین، ‮‭IPTG‬ و‮‭Gal - X‬مورد غربال‌گری واقع شدند .کلنی‌های سفید جهت تشخیص دریافت یا عدم دریافت ‮‭DNA‬ خارجی توسط کلنی ‮‭PCR‬ تکثیر یافته و با الکتروفورز کلنی‌های مطلوب مشخص گردیدند .سپس کلنی‌های سفید مطلوب در محیط کشت ‮‭LB‬ مایع حاوی آمپی‌سیلین به صورت شبانه کشت داده شدند .پلاسمید کلنی‌های مذکور به دو روش لیز آلکالینی و کیت استخراج شرکت‮‭BIONEER‬ ، استخراج گردیدند .پلاسمیدهای استخراج شده با آنزیم ‮‭BamHI‬ با محل اثر در دو طرف محل اتصال ‮‭DNA‬ خارجی در پلاسمید، برش داده شدند .پس از برش پلاسمید، جهت تایید همسانه‌سازی، الکتروفورز انجام گرفت .قطعه آزاد شده ‮‭(DNA‬ خارجی (جهت خالص‌سازی از ژل برش داده شد و با استفاده از کیت خالص‌سازی‮‭BIONEER‬ ، خالص گردید ‮‭DNA‬ .خالص‌سازی شده برای تعیین توالی ارسال گردید .سپس نتایج حاصل از توالی‌یابی مورد آنالیز با نرم‌افزارهای مختلف بیوانفورماتیک قرار گرفت که به موجب آن ساختار، توالی آمینواسیدی و خصوصیات بیوشیمیایی مشخص شدند .آنالیز داده‌ها حدود ‮‭۷۰‬ تا ‮‭۹۹‬ درصد شباهت با داده‌های موجود در ژن‌بانک را تایید نمود

Text of Note

Viruses cause a lot yield loss to crops annually. However, there is no chemical compound to commercially eliminate plant viruses. In recent years, the use of extracts from some plant species that contain antiviral proteins to control viral diseases has been considered. One of the antiviral proteins is Phytolacca americana (Pokeweed) protein (PAP). PAP is a ribosome inhibiting protein (RIP), which plays an important defense role in the plant against viruses. PAP has a damaging effect on dsRNAs and since most viral RNA viruses have dsRNA genomes or produce dsRNA in their reproduction, it can be used to control viral diseases. Pokeweed ribosome inactivating proteins include PAP-I, PAP-II, PAP-III and PAP-S, which are PAP isoforms isolated from spring leaves, early summer leaves, late summer leaves and seeds of the plant. The purpose of this research was to isolate and identify the PAP-I gene from Phytolacca americana (Pokeweed) in Iran. For this purpose, after PCR amplification of PAP gene with specific primers, restriction analysis was performed with the restriction enzymes EcoRI, Eco321, AluI, SalI and SacI which were determined to have cutting sites in the PAP gene according to restriction map analysis of the PAP sequences in GenBank as a result, the restriction pattern of the studied gene was determined. Also, the restriction pattern of the native samples was compared with that of the related data recorded in the Genbank to find out the difference between Iranian samples and pre-viously recorded specimens from other countries. In order to clone the PAP gene, the PCR product was ligated into the plasmid pTG19-T (CinaClon, Iran) and after ligation, the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli strain DH5?. The transformed bacteria were screened on LB medium containing ampicillin, IPTG and X-Gal. White colonies were detected by colony PCR to confirm insertion of the PAP fragment into the plasmid, and the desired colonies were further analyzed by electrophoresis of the restricted recombinant plasmid. Then, the desired white colonies were cultured in LB broth containing ampicillin overnight, and their plasmids were extracted in two methods: alkaline lysis and BIONEER extraction kit. Extracted plasmids were cut by the BamHI enzyme with the site of action on both sides of the outer DNA binding site in the plasmid. The released fragment (external DNA) was purified using a BIONEER purification kit. The purified DNA was sent to Microsynth Company in Switzerland for sequencing. Then, the results of the sequencing were analyzed by various bioinformatics software, which determined the structure, amino acid sequencing and biochemical characteristics. The data analysis confirmed about 70 to 99 of the similarity with the Genbank's data

Parallel Title

‮‭Isolation and identification of PAP gene from Phytolacca americana in Iran‬

محبی ملکی، اعظم

Mohebbi Maleki, Azam

سخندان بشیر، نعمت، استاد راهنما

دورانی، ابراهیم، استاد مشاور

دباغ‌محمدی‌نسب، عادل، استاد مشاور

Public note

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی