عنوان

مکان‌یابی قارچ ‮‭Rhizophagus irregularis‬ در گره ریشه شبدر در پاسخ به تامین نیتروژن با بکارگیری سنجش ایمنوفلورسانس غیرمستقیم,‮‭Localization of Rhizophagus irregularis in clover root nodule in response to nitrogen supply by using indirect immunoflourescens assay‬

Number

‭۱۹۸۸۸پ‬

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

مکان‌یابی قارچ ‮‭Rhizophagus irregularis‬ در گره ریشه شبدر در پاسخ به تامین نیتروژن با بکارگیری سنجش ایمنوفلورسانس غیرمستقیم

Parallel Title Proper

‮‭Localization of Rhizophagus irregularis in clover root nodule in response to nitrogen supply by using indirect immunoflourescens assay‬

First Statement of Responsibility

/وحیده شعبانی زنوزق

Name of Publisher, Distributor, etc.

: کشاورزی

Date of Publication, Distribution, etc.

، ‮‭۱۳۹۷‬

Specific Material Designation and Extent of Item

‮‭۱۴۹‬ص‬

Text of Note

چاپی - الکترونیکی

Dissertation or thesis details and type of degree

دکتری

Discipline of degree

علوم و مهندسی خاک گرایش بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک

Date of degree

‮‭۱۳۹۷/۰۶/۱۸‬

Body granting the degree

تبریز

Text of Note

گیاهان لگوم همزیستی سه جانبه با قارچ‌های میکوریز آربوسکولار ‮‭(AM)‬ و باکتری‌های ریزوبیوم دارند .در همزیستی لگوم-ریزوبیوم، گره‌ها ساختار ویژه‌ای هستند که محل تثبیت نیتروژن می‌باشد .ترکیبات معدنی نیتروژن اثر بازدارنده بر تشکیل گره ریشه‌ای دارند .منابع نیتروژن به فرم نیترات و آمونیوم عمدتا از طریق تاثیر بر فیزیولوژی گیاه میزبان و ژن‌های کدکننده فاکتورهای گره‌سازی باکتری‮‭(nodABC)‬ ، از تشکیل همزیستی جلوگیری می‌کند .گره ریزوبیومی دارای ناحیه‌های مختلف با سطوح متفاوتی از گونه‌های فعال اکسیژن ‮‭(ROS)‬ است که سبب توزیع متغیر باکتری در این ناحیه‌ها می‌شود .همچنین شواهدی در دست است که نشان می‌دهند قارچ‌های میکوریز آربوسکولار علاوه بر کلنیزاسیون ریشه لگوم‌ها، در گره‌ها نیز کلنیزاسیون ایجاد می‌کنند .به نظر می‌رسد که حضور باکتری ممکن است توزیع مکانی و زمانی قارچ همزیست را در گره و ناحیه‌های آن تغییر دهد .در این تحقیق گیاه شبدر سفید (.‮‭(Trifolium repense L‬ با قارچ ‮‭Rhizophagus irregularis‬ و باکتری ‮‭Rhizobium leguminosarum bv. trifolii‬ مایه‌زنی شد و تاثیر غلظت‌های مختلف نیتروژن محلول غذایی‮‭(۰‬ ، ‮‭۲, ۶‬ و ‮‭۱۰‬ میلی‌مولار به فرم نیترات (در بستر شنی استریل، مورد بررسی قرار گرفت .گلدان‌ها توسط غشاء نایلونی با منافذ ‮‭۳۷‬ میکرومتر به دو بخش ریشه‌ای و هیفی تقسیم شدند .تیمار قارچی شامل دو سطح بدون قارچ و با مایه‌زنی قارچ و باکتری ریزوبیوم در دو سطح بدون باکتری و با مایه‌زنی باکتری بود .هر تیمار دارای ‮‭۹‬ تکرار بود که سه سری گلدان برای هر دوره زمانی در نظر گرفته شد .جهت بررسی توزیع مکانی قارچ میکوریز در دوره‌های زمانی‮‭۳۰‬ ، ‮‭۶۰‬ و ‮‭۹۰‬ روزه از گره‌ها نمونه‌برداری شد و سپس توزیع مکانی قارچ میکوریز در بافت گره ریشه شبدر به کمک روش ایمنوفلورسنس با آنتی‌بادی منوکلونال ‮‭MAb۳۲B۱۱‬ و تصویربرداری به کمک میکروسکوپ فلورسنت مورد بررسی قرار گرفت .قسمت هوایی گیاهان برداشت شد و بستر شنی در بخش‌های ریشه‌ای و هیفی برای استخراج گلومالین مورد استفاده قرار گرفت و مقدار گلومالین با استفاده از آنتی‌بادی ‮‭MAb۳۲B۱۱‬ و روش الایزا ‮‭(ELISA)‬ اندازه‌گیری شد .همچنین صفاتی نظیر وزن خشک ریشه و اندام هوایی، تعداد و وزن تر گره، درصد کلونیزاسیون قارچی ریشه‌ها و غلظت فسفر، نیتروژن و پتاسیم در گیاه، اندازه‌گیری شد .نتایج نشان داد که با افزایش غلظت نیتروژن تا سطح ‮‭۲‬ میلی‌مولار وزن خشک اندام هوایی و ریشه به طور معنی‌داری افزایش پیدا کرد .(>‮‭(۰۱/۰ p‬ سپس با افزایش غلظت نیتروژن از ‮‭۲‬ میلی‌مولار تا ‮‭۱۰‬ میلی‌مولار کاهش معنی‌داری در وزن خشک اندام هوایی و ریشه مشاهده شد .در همه زمان‌ها حضور باکتری سبب افزایش معنی‌داری در وزن خشک اندام هوایی و ریشه شد و بیشترین وزن خشک اندام هوایی و ریشه در ماه سوم و در حضور باکتری ریزوبیوم مشاهده شد .در حضور قارچ میکوریز وزن خشک اندام هوایی افزایش پیدا کرد، ولی در حضور توام قارچ ‮‭AM‬ و باکتری ریزوبیوم این افزایش به مراتب بیشتر از زمانی بود که هر یک از میکروارگانیسم‌ها به تنهایی حضور داشتند .بیشترین درصد کلنیزاسیون میکوریزی ‮‭(۵۸/۶۶‬ درصد (در تیمارهای دارای قارچ و سطح ‮‭۲‬ میلی‌مولار نیتروژن مشاهده شد .در تمام سطوح نیتروژن حضور باکتری ریزوبیوم سبب افزایش معنی‌داری در درصد کلنیزاسیون میکوریزی شد .همچنین حضور توام قارچ میکوریز و باکتری ریزوبیوم سبب افزایش معنی‌داری در درصد کلنیزاسیون شد .مایه‌زنی گیاهان توسط باکتری ریزوبیوم سبب ایجاد گره‌های ریشه‌ای شده ولی در تیمارهای بدون باکتری) شاهد (تشکیل گره بر روی ریشه صورت نگرفت .قارچ میکوریز سبب افزایش در تعداد و وزن گره شد(>‮‭(۰۱/۰p‬ ، با این حال بیشترین افزایش در تعداد و وزن گره زمانی بود که باکتری و قارچ به طور همزمان در گیاه حضور داشتند .با افزایش غلظت نیتروژن وزن تر و تعداد گره به طور معنی‌داری کاهش یافت .بیشترین وزن و تعداد گره در ماه دوم و در سطح صفر میلی‌مولار نیتروژن مشاهده شد .در هر سه دوره زمانی با افزایش سطح نیتروژن، وزن و تعداد گره کاهش معنی‌داری پیدا کرد، و اوج تشکیل گره در ماه دوم و در سطح صفر میلی‌مولار بود .از تصاویر میکروسکوپی چنین برمی‌آید که ناحیه مرکزی گره دارای بیشترین اندام‌های قارچی) به‌ویژه وزیکول (در زمان ‮‭۶۰‬ روز بود .هچنین نتایج نشان داد که اثر نیتروژن بر حضور قارچ ‮‭AM‬ در گره و همچنین مقدار گلومالین گره اندازه‌گیری شده با روش‌های بردفورد و آنتی‌بادی مونوکلونال مثبت و معنی‌دار بود و بیشترین حضور قارچ ‮‭AM‬ در گره و همچنین بیشترین مقدار گلومالین) به عنوان شاخصی از جمعیت قارچ میکوریز (در سطح ‮‭۲‬ میلی‌مولار نیتروژن بود و در سطوح کمتر و یا بیشتر از این سطح میزان حضور قارچ و مقدار گلومالین کاهش یافت .در ‮‭۹۰‬ روز پس از کشت، با توجه به تصاویر میکروسکوپی مشاهده شد که درصد کلنیزاسیون گره‌ها نسبت به ماه دوم کاهش پیدا کرده است، ولی میزان آن بیشتر از ماه اول بود .اثر نیتروژن بر مقدار گلومالین واکنش‌پذیر با آنتی‌بادی در بخش شن هیفی‮‭(SH)‬ ، بخش شن) هیف +ریشه ‮‭(SHR)‬ (و همچنین گلومالین ریشه‌ای واکنش‌پذیر با بردفورد غیرمعنی‌دار بود ولی اثر آن بر مقدار گلومالین ریشه‌ای و گلومالین گره واکنش‌پذیر با آنتی‌بادی معنی‌دار بود و بیشترین مقدار آن در سطح ‮‭۲‬ میلی‌مولار نیتروژن مشاهده شد .حداکثر مقدار گلومالین واکنش‌پذیر بردفورد در بخش ‮‭SHR‬ در سطح ‮‭۶‬ میلی‌مولار مشاهده شد .در تیمارهای میکوریزی، حضور باکتری سبب افزایش مقدار گلومالین در بخش‌های‮‭SH‬ ،‮‭SHR‬ ، ریشه و گره شد که خود بیانی از افزایش کلنیزاسیون قارچی و در نتیجه بیانی از اثر سینرژیستی این دو میکروارگانیسم در گره می‌باشد .در نهایت می‌توان نتیجه گرفت که گلومالین به عنوان شاخص بیوماس ‮‭AMF‬ در ‮‭۶۰‬ روز پس از کشت بوده در در سطح ‮‭۲‬ میلی‌مولار نیتروژن و در ناحیه مرکزی گره‌ها بیشترین میزان را داشت .منطقه مرکزی گره ریشه به عنوان محل تثبیت نیتروژن بوده و توسط باکتروئیدهای فعال تثبیت کننده اشغال می‌شود .سطوح بیشتر از ‮‭۲‬ میلی‌مولار نیتروژن اثرات مهار کنندگی بر تشکیل گره و در نتیجه استقرار قارچ ‮‭AM‬ نشان دادند که توسط عکس‌برداری میکروسکوپی و روش ایمونوفلورسنس تعیین شد

Text of Note

Legumes form a tripartite symbiosis with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and rhizibia. In legume-rhizobium symbiosis, root nodules are specific organs for nitrogen fixation. Inorganic nitrogen compounds have inhibitory effects on the formation of root nodules. Nitrogen sources in the form of nitrate and ammonium, inhibit the stablishment of symbiosis and formation of nodules, mainly through the effects on host plant physiology and the bacterial Nod factors (nodABC). The nodule has different zones with different levels of reactive oxygen species (ROS) which cause uneven distribution of bacteria in these zones. There is also evidence that AMF, along with root colonization of legumes could enter nodules and colonize them. It seems that the presence of bacteria may alter the spatial and temporal distribution of the AMF in nodule zones. In a pot culture experiment with washed sand, clover (Trifolium repens L.) plants were inoculated with Rhizophagus irregularis and/or Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii. Four levels of nitrogen (0, 2, 6 and 10 mM as nitrate) in Newman & Romheld nutrient solution were applied to the pots. A nylon mesh (37 m, NBC Meshtec Inc.) bag was placed in the center of the pot to form root compartment (RC) and hyphal compartment (HC). Non-mycorrhizal and non-bacterial plants left un-inoculate as controls. Each treatment repeated for 9 times to achieve 3 replications for three time period. To investigate the spatial distribution of mycorrhizal fungus, the nodules were sampled during time period of 30, 60, and 90 days. The immunofluorescence assay with monoclonal antibody MAb32B11 and imaging with fluorescent microscope was used illustrate the presence of mycorrhizal fungus in the roots and nodules. In each time period shoots and roots were harvested and the glomalin was extracted from hyphae and root compartments as well as from sand and nodule tissues and quantified by the Bradford and monoclonal antibody 32B11 assays (ELISA). Also, shoot and root dry weights, nodule weights and numbers, root colonization, phosphorus, nitrogen and potassium content in shoot and root were determined. The results showed that with increasing nitrogen concentration up to 2 mM, shoot and root dry weight increased significantly. But a significant decrease in shoot and root dry weights were observed, with increasing nitrogen level from 2 to 10 mM. At all time periods, presence of bacteria significantly increased the dry weight of the shoot and root. The highest shoot and root dry weights were recorded after 90 days in the presence of bacteria. Although the presence of mycorrhizal fungus or rhizobium bacterium alone coused a significant increase in shoot dry weight, but the highest was achieved in co-inoculation. The highest percentage of mycorrhizal root colonization (66.58 ) was observed in mycorrhizal treatments at 2 mM nitrogen level. At all levels of nitrogen, the presence of rhizobial bacterium caused a marked increase in percentage of root colonization, indicating a synergistic effect of both microsymbionts. Non-bacterial roots were nodule free, indicating the sterile conditions during the growth period. The mycorrhizal fungus increased the number and weight of nodules (p <0.01), and the highest was observed in co-inoculated plants. With increasing nitrogen level, the fresh weight and number of nodules decreased significantly (p<0.01). The highest weight and number of nodules were observed after 60 days at 0mM nitrogen. In all three time periods, the weight and number of nodules decreased significantly with increasing nitrogen level, and the nodule formation peaked after 60 days at 0mM nitrogen. Considering microscopic images, it can be seen that the central zone of the nodules had the most fungal organs (especially vesicles) after 60 days. The results also showed that the effect of nitrogen were significant on the AMF colonization and glomalin content of nodule. The highest AMF colonization and glomalin content were recorded at 2 mM nitrogen level. At levels less than or greater than this level, the AMF colonization and glomalin content declined. According to the microscopic images, the percentage of AMF colonization in nodules decreased in after 90 days planting, although it was more than the first month. The effect of nitrogen levels on immunoreactive and Bradford-reactive glomalin in the hyphae (SH), (hyphae + root) (SHR) compartments was non-significant, however, its effect on the amount of root and nodule immunoreactive glomalin was significant and the highest amount was observed at 2 mM nitrogen levels. The maximum amount of bradford-reactive glomalin in the SHR compartment was observed at 6 mM. In mycorrhizal treatments, the presence of bacteria increased the amount of glomalin in the SH, SHR, root and nodules, emphases again the synergistic effects of these two microsymbionts inside the nodule. It can be concluded that the glomalin as an indicator of AMF biomas was the most frequent in central zone of nodules after 60 of planting at 2 mM nitrogen level. The central zone of root nodule is assigned as nitrogen fixation site and occupied with active bacteroids. The nitrogen levels above the 2 mM exhibited an inhibitory effect on nodule formation and subsequent AMF colonization which determined by both microscopic visualization and immunofluorescence assay

Parallel Title

‮‭Localization of Rhizophagus irregularis in clover root nodule in response to nitrogen supply by using indirect immunoflourescens assay‬

شعبانی زنوزق، وحیده

Shaabani Zenoozagh, Vahideh

علی‌اصغرزاد، ناصر، استاد راهنما

مجیدی، جعفر، استاد راهنما

حاجی‌بلند، رقیه، استاد مشاور

برادران، بهزاد، استاد مشاور

Public note

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی