عنوان

بررسی مقاومت ناشی از ساختار ‮‭RNA‬ سنجاق سری دوگانه در برابر ویروس برگ بادبزنی مو

Number

‭۱۶۸۱۹پ‬

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

بررسی مقاومت ناشی از ساختار ‮‭RNA‬ سنجاق سری دوگانه در برابر ویروس برگ بادبزنی مو

First Statement of Responsibility

/سمیرا پاکباز

Name of Publisher, Distributor, etc.

: کشاورزی

Date of Publication, Distribution, etc.

، ‮‭۱۳۹۵‬

Text of Note

چاپی

Dissertation or thesis details and type of degree

دکتری

Discipline of degree

بیماری‌شناسی گیاهی

Date of degree

‮‭۱۳۹۵/۰۶/۰۲‬

Body granting the degree

تبریز

Text of Note

ویروس برگ بادبزنی مو ‮‭(GFLV‬ ، ‮‭Grapevine fanleaf virus)‬متعلق به جنس ‮‭Nepovirus‬ و عامل یکی از شایع‌صترین و مخرب‌صترین بیماری‌صهای ویروسی مو در سراسر دنیا است که تا ‮‭۸۰‬ درصد خسارت می‌صزند و کیفیت و طول عمر مو را در تاکستان‌صها کاهش می‌صدهد .استفاده از ارقام مقاوم گیاهی بهترین راه برای کنترل عوامل ویروسی می‌صباشد .القاء مقاومت به واسطه ‮‭RNA Silencing‬ یک روش خوب و کارا برای ایجاد ارقام مقاوم به ویروس‌صها می‌صباشد .از طرف دیگر مهار خاموشی ژن می‌صتواند به طور مؤثری توسط مهارکننده‌صهای خاموشی ویروسی ‮‭(VSRs)‬ که قابلیت سرکوب سیستم خاموشی میزبان و ایجاد آلودگی را دارند، صورت گیرد .مهارکننده‌صهای خاموشی در بیشتر جنس‌صهای ویروسی گیاهی به خوبی توصیف شده‌صاند، اما شناسایی آن‌صها در اعضاء جنس ‮‭Nepovirus‬ کمتر بررسی شده است و دانش ما از تعیین کننده‌صهای علایم و مهارکننده‌صهای خاموشی در ویروس‌صهای این جنس خیلی محدود است .در این تحقیق جهت تعیین مهارکننده خاموشی در‮‭GFLV‬ ، ژن ‮‭GFP‬ در لاین ‮‭۱۶c‬ گیاهان تراریخت ‮‭Nicotiana benthamiana‬ که بیان کننده پروتئین فلورسنت سبز می‌صباشد، با استفاده از ناقل ویروسی‮‭EGFP - pTRV‬خاموش شد .سپس توانایی هفت پروتئین رمز شده از ژنوم ‮‭GFLV‬ در مهار خاموشی ژن ‮‭GFP‬ و به کمک تکنیک بیان موقت ژن در این گیاهان ارزیابی شد .عملکرد این پروتئین‌صها با کنترل‌صهای مثبت و منفی به کاربرده شده در این تحقیق مقایسه گردید .نتایج نشان داد که پروتئین‌صهای رمز شده توسط دو ژن ‮‭۱A‬ و‮‭۱B‬ ، عملکردی مشابه با کنترل مثبت ‮‭p۲۴‬ در مهار خاموشی ژن دارند .سپس با ساخت سازه‌صی حامل توالی کامل نوکلئوتیدی هر دو ژن ‮‭۱A‬ و‮‭۱B‬ ، توانایی مهارکنندگی خاموشی این دو ژن برای اولین بار در ویروس برگ بادبزنی مو ‮‭(GFLV)‬ به عنوان یک عضو مهم و اقتصادی از ‮‭Nepovirus‬ تأیید گردید .جهت بررسی امکان ایجاد مقاومت به ‮‭GFLV‬ با استفاده از سیستم القاء مقاومت به واسطه ‮‭RNA‬ از توالی نوکلئوتیدی این دو ژن برای ساخت سازه سنجاق‌صسری استفاده شد که در آن قطعه‌صای از هر ژن به طور جداگانه در جهت سنس و آنتی سنس در دو طرف یک ناحیه اینترونی و در مقابل پیش‌صبر ‮‭۳۵SCaMV‬ در پلاسمید ‮‭pGA۴۸۲G‬ قرار گرفت .این سازه پس از نسخه‌صبرداری حالت سنجاق‌صسری به خود گرفته و القاءکننده مکانیسم خاموشی ژن در گیاه می‌صباشد .جهت تراریختی توتون با این سازه از سیستم آگروباکتریوم استفاده شد .پس از تأیید انتقال ژن به گیاهان با استفاده از آزمون‮‭PCR‬ ، گیاهان تراریخت به منظور ارزیابی مقاومت نسبت به‮‭GFLV‬ ، مایه‌صزنی مکانیکی شدند ‮‭۱۰‬ .روز پس از مایه‌صزنی ویروس سه نوع واکنش مقاومت، حساسیت و تأخیر در بروز علایم در گیاهان مایه‌صزنی شده مشاهده شد .آزمون الایزا نیز عدم حضور ویروس را در گیاهان مقاوم تراریخت تأیید کرد .در این گیاهان حتی یک ماه پس از مایه‌صزنی، هیچ‌صگونه علایم ویروسی مشاهده نشد .درحالی که گیاهان تراریختی که حضور ویروس در آن‌صها با آزمون الایزا ردیابی شد، علایم موزاییک را یک هفته پس از مایه‌صزنی و مشابه تیپ وحشی گیاهان مایه‌صزنی شده با ‮‭GFLV‬ نشان دادند .نتایج این تحقیق نشان داد که سازه‮‭۱B + ۱A‬به کار رفته برای القاء مقاومت کارایی بالایی داشته و می‌صتوان از آن برای ایجاد مقاومت در ارقام مختلف مو نسبت به ‮‭GFLV‬ استفاده کرد

Text of Note

Grapevine fanleaf virus (GFLV) is a member of the genus Nepovirus and one of the most common and destructive viral diseases of grapevines worldwide that causes significant crop losses (80 ) and reduces fruit quality and shortens the longevity of grapevines in the vineyards. The most efficient method to control viruses is the use of resistant plant varieties. The RNA silencing-based resistance is the best way to establish the resistant plants against viruses. However gene silencing can be effectively inhibited by virus-encoded silencing suppressors (VSRs) which surmount host silencing system and allow infection. VSRs are well described in most plant virus genera, but their identification in Nepovirus is pending, and our knowledge of symptom determinants and VSRs of viruses from this genus is very limited. In this study in order to determine silencing suppressor of GFLV, the GFP gene was silenced in GFP-transgenic Nicotiana benthamiana 16c line by pTRV-EGFP and then the ability of the seven encoded proteins from GFLV was evaluated for suppression of gene silencing using Agrobacterium-mediated transient gene expression assay. The efficiency of these proteins was compared with positive and negative controls. The results showed that the efficiency of 1A and 1B genes is very similar to p24, a positive control which suppresses gene silencing. Then a construct including complete nucleotide sequence of 1A and 1B genes was developed and their efficiency in plant was evaluated and the ability of these two genes in suppression of gene silencing was confirmed for the first time in GFLV as an important and economic member of Nepoviruses. In order to investigate the possibility of induction of resistance against GFLV using RNA-mediated induction of resistance, nucleotide sequence of 1A and 1B genes was used to produce a hairpin construct. The construct was developed using intron and also the fragments in sense and antisense directions in front of 35S promoter in pGA482G. This construct will make a hairpin structure after transcription and induce mechanism of gene silencing in plant. A. tumefaciens was used to transform N. benthamiana plants. To evaluate resistance to GFLV after confirmation of transformation by PCR reaction, the transgenic plants were mechanically inoculated with this virus. Ten days after virus inoculation, the inoculated plants showed various reactions including resistance, susceptibility and delay in symptom production. ELISA assay confirmed the absence of virus in resistant transgenic plants. No symptom was observed in these plants even a month after inoculation. The transgenic plants in which the virus was detected by ELISA reaction, mosaic symptom similar to that in wild type plants was appeared one week after inoculation. The results of this study showed that both 1A and 1B genes from GFLV suppress gene silencing and a hairpin construct containing a fragment of 1A+1B is efficient to establish resistance to this virus and it could apply to produce resistance in different varieties of grape

پاکباز، سمیرا

پژوهنده، مقصود، استاد راهنما

گندمانی، امید عینی، استاد مشاور

Public note

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی