بررسی تغییر بیان برخی پروتئین های درگیر در القای آپوپتوز توسط ترکیبی فعال از خانواده ی اسپیروکوئینازولینون در رده ی سلولیa- KG۱، مدلی از سلول های بنیادی لوکمیک
First Statement of Responsibility
/آرزو رحیمیان
.PUBLICATION, DISTRIBUTION, ETC
Name of Publisher, Distributor, etc.
: علوم طبیعی
Date of Publication, Distribution, etc.
، ۱۳۹۵
Name of Manufacturer
، راشدی
NOTES PERTAINING TO PUBLICATION, DISTRIBUTION, ETC.
Text of Note
چاپی
DISSERTATION (THESIS) NOTE
Dissertation or thesis details and type of degree
کارشناسی ارشد
Discipline of degree
زیست شناسی گرایش بیوشیمی
Date of degree
۱۳۹۵/۱۱/۱۲
Body granting the degree
تبریز
SUMMARY OR ABSTRACT
Text of Note
لوکمی میلوئید حاد، بدخیمی خونی هتروژن و تهاجمی می باشد که با توسعه ی کلونال بلاست های میلوئیدی نابالغ مشخص شده است .سلول های بنیادی لوکمیک به این دلیل که به اغلب درمان های رایج مقاومت نشان می دهند، عامل اصلی شکست درمان و عود بیماری در نظر گرفته می شوند .رده ی سلولیa- KG۱، زیر رده ای از رده ی سلولی AML انسانیKG۱ ، از بلاست های نابالغ تشکیل یافته و بعنوان مدلی از سلول های بنیادی لوکمیک در نظر گرفته می شود .القای آپوپتوز استراتژی موثری در درمان سرطان شناخته شده و مشتقات اسپیروکوئینازولینی بعنوان ترکیبات هتروسایکل دارای نیتروژن، فعالیت های زیستی گسترده ای از خود نشان داده و از جمله عوامل بالقوه ی القاگر آپوپتوز می باشند .اعضای دو خانواده ی پروتئینی IAP و Bcl۲ نقش مهمی در تنظیم آپوپتوز ایفا می کنندSurvivin .، از اعضای خانواده ی IAP دارای فعالیت مهار آپوپتوزی بوده و بیان بالایی در سلول هایKG۱ - aدارد .همچنین پروتئین Bcl۲ از زیر گروه پروتئین های ضد آپوپتوزی خانواده یBcl۲ ، با جلوگیری از عملکرد القای آپوپتوز) Bax عضو پیش آپوپتوزی این خانواده (از وقوع آپوپتوز جلوگیری می نماید و در سلول های مقاوم به درمان نسبت بالای Bcl۲/Bax گزارش شده است .در این مطالعه اثر القای آپوپتوز مشتق اسپیروکوئینازولینونیCHQ - ۴tدر مقایسه با مشتقQTC - ۴tبر روی رده ی سلولیKG۱ - aمورد بررسی قرار گرفته است .سلول ها با غلظت های ۱۰تا ۱۵۰میکرو مولار از هر دو ترکیب تیمار شده و بقای سلولی توسط آزمون MTT تعیین گردید .غلظت مهاری ۵۰با استفاده از اندازه گیری جذب بلورهای حاصل بدست آمد .وقوع آپوپتوز توسط رنگ آمیزی سلولی با رنگ های فلورسنس اکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید و تصویر برداری با میکروسکوپ فلورسنس، آنالیز ایجاد قطعات DNA از طریق الکتروفورز در آگاروز، آنالیز چرخه ی سلولی و رنگ آمیزی دوگانه ی AnnexinV/PI از طریق فلوسیتومتری مورد بررسی قرار گرفت .علاوه بر این، تغییرات بیان پروتئین هایSurvivin ، Bax و Bcl۲ توسط تکنیک ایمونوبلات ارزیابی گردید .بر اساس سنجشMTT ، مشتقCHQ - ۴tبا IC۵۰ ۵/۱۳۱ میکرو مولار در ۷۲ ساعت برای ارزیابی های بعدی انتخاب گردید .نتایج نشان دهنده ی تغییرات مورفولوژیک همراه با فشردگی کروماتین، ایجاد قطعات DNA و توقف در مرحله ی G۰/G۱ از چرخه ی سلولی پس از تیمار سلول ها با ترکیب) در غلظت IC۵۰) بودند .حضور فسفاتیدیل سرین در نیم لایه ی خارجی غشای سلولی وقوع آپوپتوز در سلول هایKG۱ - aرا بعد از تیمار باCHQ - ۴tتایید نمود .کاهش بیان Survivin ، همچنین افزایش نسبت بیان پروتئین های Bax/Bcl۲ با افزایش زمان تیمار، توسط وسترن بلات نتیجه گیری شد .طبق داده های شبیه سازی داکینگ، دومین های عملکردی BH۳ از Bcl۲ و BIR از Survivin نواحی اتصال مشتقCHQ - ۴tبودند .نتایج حاصل بیانگر اثر القای آپوپتوز مشتق اسپیروکوئینازولینونیCHQ - ۴tدر رده ی سلولی AML انسانیKG۱ - aمی باشند
Text of Note
Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous hematologic malignancy characterized by the clonal expansion of immature myeloid blasts. As leukemic stem cells are resistant against most of current cancer treatments, they are the main reason for treatment failure and disease relapse. KG1-a variant derived from the human acute myelogenous leukemia cell line KG1, is composed of undifferentiated blast cells and is considered as a leukemic stem cell model. Apoptosis induction is an effective strategy in cancer therapy and Spiro-quinazolinone derivatives as N-heterocyclic compounds, which have widespread bioactivities, have been considered as a potent apoptosis inducing agents. In the apoptosis pathway, the Bcl2 and IAP proteins family are the central regulators. Survivin as a member of IAP family as a suppressor of apoptosis is up regulated in the KG1-a cells. Also Bcl2 as an anti-apoptotic member of Bcl2 family, suppress apoptosis with inhibiting Bax (pro-apoptotic member of bcl2 family) function. High levels of Bcl2/Bax expression have been reported in many drug resistant cancerous cells. In this study we investigated the apoptosis inducing effect of 4t-CHQ from Spiro-quinazolinone derivatives compared to 4t-QTC in the KG1-a cell line. The cells were treated with 10 to 150 M of both derivatives and then cell viability was determined using MTT assay. Inhibition concentration of 50 were determined using resultant formazan absorption. Apoptosis was evaluated using acridine orange/ ethidium bromide fluorescent dies and imaging with fluorescence microscopy, DNA fragmentation assay with agarose gel electrophoresis, cell cycle and AnnexinV/PI double staining assessment with flowcytometry. Furthermore, Survivin, Bcl2 and Bax expression changes were investigated using western blotting. According to MTT assay, 4t-CHQ derivative with IC50 value of 131.5 M were chosen for further evaluations. Results indicated that the cells showed morphologic changes with chromatin condensation, DNA fragmentation, G0/G1 cell cycle arrest after treatment with the compound (at IC50 value). Presence of phosphatidyl serine on the outer surface of the cell membrane, confirmed the apoptosis occurrence in the KG1-a cells after treatment with the 4t-CHQ compound. Down regulation of Survivin as well as increasing in the Bax/Bcl2 ratio were resulted time dependently from western blotting. According to docking simulation data, functional BH3 domain of Bcl2 and BIR domain of Survivin were the binding sites for 4t-CHQ. These results represent induction of apoptosis by 4t-CHQ from Spiroquinazolinone derivatives in the KG1-a human AML cell line