عنوان

توسعه مگنتوبیوسنسور الکتروشیمیایی ‮‭DNA‬ ی تقویت شده با شبکه لیپوزومی برای شناسایی و اندازه‌گیری الیگونوکلئوتید هم توالی با‮‭۲۱) - miRNA‬بیومارکر سرطان ریه)

Number

‭۱۶۱۸۹پ‬

.Language of Text, Soundtrack etc

per

Title Proper

توسعه مگنتوبیوسنسور الکتروشیمیایی ‮‭DNA‬ ی تقویت شده با شبکه لیپوزومی برای شناسایی و اندازه‌گیری الیگونوکلئوتید هم توالی با‮‭۲۱) - miRNA‬بیومارکر سرطان ریه)

First Statement of Responsibility

/توحید محمودی بادکی

Name of Publisher, Distributor, etc.

: شیمی

Date of Publication, Distribution, etc.

، ‮‭۱۳۹۵‬

Text of Note

چاپی

Dissertation or thesis details and type of degree

کارشناسی ارشد

Discipline of degree

شیمی کاربردی

Date of degree

‮‭۱۳۹۵/۱۱/۱۷‬

Body granting the degree

تبریز

Text of Note

در ابتدا دو نوع دانة مغناطیسی با هسته‌های از جنس نانو ذرات مغناطیسی ‮‭Fe۳O۴‬ و -‮‭Fe۲O۳‬با پوستة طلا، سنتز و با تکنیک‌های‮‭Vis- UV‬،‮‭XRD‬ ،‮‭SEM‬ ،‮‭EDS‬ ،‮‭TEM‬ ، ‮‭VSM‬ و روش الکتروشیمیایی تأیید ساختار شدند .از روش ترسیب همزمان برای سنتز هستة مغناطیسی و از روش احیاء با سیترات برای سنتز پوستة طلا استفاده شد .تثبیت پروب تیوله بر سطح دانه‌های مغناطیسی نیز با استفاده از تکینک‌های‮‭Vis - UV‬و الکتروشیمیایی تأیید شد .با اصلاح الکترود کربن شیشه‌ای تجاری با قطره‌گذاری نانولوله‌های کربنی چند جدارة تیمار شده با اسید، الکترود ارزان قیمت و ساده‌ای برای اندازه‌گیری آسان، حساس و تکرار پذیر دوپامین در حضور متانول به عنوان عامل تخریب کننده لیپوزوم، بدست آمد .در مرحله بعد، لیپوزوم‌های بارگیری شده با دوپامین به روش هیدراته کردن لایة نازک با میزان بارگذاری تقریبا ‮‭۳۰‬ تهیه شدند .نتایج ‮‭DLS‬ نشان داد که اعمال فرآیند اولتراسونیک باعث کاهش اندازة لیپوزوم‌ها از ‮‭nm ۲۵۴‬ به ‮‭nm ۱۱۷‬ شد .بررسی اثرات فولینگ برای مواد متداول بکار رفته در تخریب لیپوزوم ها، شامل سورفاکتانتهای‮‭۱۰۰ -X- Triton‬و‮‭۲۰ - Tween‬در دو حلال متانول و آب و نیز خود حلال متانول به تنهایی، نشان داد که استفاده از سورفاکتانت‌ها ضرورتی ندارد و استفاده از نسبت حجمی ‮‭۲‬ به ‮‭۱‬ از متانول به لیپیوزوم برای تخریب لیپوزوم‌ها و اندازه‌گیری الکتروشیمیایی دوپامین آزاد شده با حداقل اثرات فولینگ مفید است .برای اولین بار، روش الکتروشیمیایی برای بررسی لیوفیلیزه کردن لیپوزوم‌های بارگیری شده با دوپامین با استفاده از ساکارز به عنوان مادة محافظ از یخ زدگی بکار رفت و نقش ساکارز در حفظ ساختار آنها بدون اثر تداخلی تأیید شد .در مرحلة بعدی، بیوتین‌دار شدن لیپوزوم‌ها با تثبیت آنها بر سطح میکرو پلیت‌های استرپتاویدین‌دار تأیید شد .بررسی رهایش لیپوزوم‌ها با استفاده از میکروپلیت، نشان داد که فرمولاسیون با نسبت مولی ‮‭۰۱/۰: ۱۰:۱‬ به ترتیب از فسفولیپید‮‭DHPE : -X- Biotin‬کلسترول : لسیتین و با وزن کلی( لسیتین+کلسترول) برابر با ‮‭mg ۶۰‬ برای بکارگیری در روش پیشنهادی مطلوب است .بلوکه کردن سطح دانه‌های مغناطیسی برای از بین بردن سیگنال کاذب ناشی از اتصال لیپوزوم‌های بیوتین‌دار از طریق گروه تیولی موجود در ساختار آنها، به دانه‌های مغناطیسی با استفاده از محلول تازه تهیه شده آلبومین سرم گاوی با غلظت ‮‭۴‬ و مدت انکوباسیون ‮‭۱‬ ‮‭h‬انجام شد .در مرحلة بعد، بررسی روش پیشنهادی با مقادیر مازاد از پروب‌های تیوله و بیوتین‌دار و در حضور غلظت‌های‮‭n۱‬ و ‮‭۱۰‬ ‮‭p‬ از توالی الیگونوکلئوتیدی هدف نشان داد که روش موفقیت آمیز است و پاسخ روش در برابر افزایش غلظت مولکول هدف، غیرخطی است .در ادامة کار، بهینه‌سازی روش با بررسی پارامترهایی شامل مقدار‮‭DNA‬ ی تیوله تثبیت شده بر سطح دانه‌های مغناطیسی، مقدار دانه‌های مغناطیسی، مقدار لیپوزوم، زمان هیبریداسیون و نوع دانة مغناطیسی انجام شد .دانة مغناطیسی با هسته‮‭Fe۳O۴‬، عملکرد بهتری نسبت به دانة مغناطیسی با هسته -‮‭Fe۲O۳‬دارد .در شرایط بهینه، ناحیة خطی بین شدت پیک ولتامتری تفاضلی برای دوپامین آزاد شده و لگاریتم غلظت مولکول هدف در بازه ‮‭fM ۱‬تا ‮‭nM ۱‬ با حد تشخیص ‮‭fM ۸۷/۰‬بدست آمد .بررسی گزینش پذیری روش با استفاده از توالی الیگونوکلئوتیدی فاقد دم ‮‭Poly(A)۲۰‬ ، نشان داد که دم‌دار کردن توالی هدف ضروری است و روش پیشنهادی عدم هیبرید شدن پروب تیوله را با آن نشان داد .در ادامه، لیپوزوم‌های لیوفیلیزه بیوتین‌دار با استفاده از ساکارز به عنوان مادة محافظ از یخ زدگی تهیه شدند و در روش پیشنهادی برای شناسایی الیگونوکلئوتید هدف با موفقیت بکار گرفته شد .ناحیه خطی بین شدت پیک ولتامتری تفاضلی برای دوپامین آزاد شده و لگاریتم غلظت مولکول هدف در بازه ‮‭pM ۱/۰‬تا ‮‭nM ۱۰‬ با حد تشخیص ‮‭fM ۰۶/۱۷‬بدست آمد .

Text of Note

Abstract: In this work for the first time, a method was developed for detection of oligonucleotides in low concentrations by using dopamine-loaded biotinilated liposomes and magnetic beads with core-shell nano structures containing iron oxide as core and Au as shell. Magnetic beads were used for immobilization of thiolated capture probe and dopamine-loaded biotinilated liposomes were used as signal amplification agent. In the presence of Poly (A)20 tailed target, a sandwich structure was formed among thiolated capture probe immobilized on magnetic beads and streptavidin conjugated biotinilated reporter probe consisting of Poly(T)20. After the addition of dopamine-loaded biotinilated liposomes, a sandwich structure was formed inwhich liposomes were conjugated to streptavidin ended reporter probe. After washing of assembly, the lysing of conjugated liposomes released dopamine that subsequently was measured by GCE/MWCNTs electrode with differential pulse voltammetry (DPV) technique. The obtained DPV signal of dopamine is proportional to target concentration in nM to fM range. In first, two magnetic beads with cores containing Fe3O4 and -Fe2O3 magnetic nano particles and Au as shell were synthesized, then their structures verified by UV-Vis, XRD, SEM, EDS, TEM, VSM and electrochemical approach. Co-precipitation and citrate reduction methods were used for synthesis of magnetic core and Au shell, respectively. The immobilization of thiolated probe on the surface of magnetic beads was verified by UV-Vis and electrochemical technique. By dropping acid treated Multi walled carbon nanotubes on commercial glassy carbon electrode surface, a cheap and simple electrode was developed for easy, sensitive and reproducible measurement of dopamine in the presence of methanol as lysing agent. In the next step, dopamine-loaded liposomes were prepared by thin layer hydration method with loading efficiency of 30. The results of DLS were approved the effect of ultra-sonication process for reducing the size of liposomes. The investigation of fouling effect of some current lysing agents, which have been used for the disruption of liposomes including surfactants of Triton-X-100 and Tween-20 in two solvents, methanol and water and also with using just methanol, showed that the application of surfactants is not necessary. Morover, the using of 2:1 volume ratio of methanol to liposomes is useful for disruption of liposomes and for electrochemical measurement of released dopamine with negligible fouling effect. For the first time, electrochemical approach was used for the investigation of lyophilization of dopamine-loaded liposomes by using sucrose as cryoprotectant and its role was verified without electrochemical interference. Then, the biotinylation of liposomes was approved by immobilization of them on streptavidin coated microplate surfaces. The investigation of releasing behavior of liposomes using microplates showed that the formulation with molar ratio of 10:1:0.01 (lecithin: cholesterol: biotin-X-DHPE) with total lipid content of 60 mg is useful for application in the proposed approach. The blocking of surface of magnetic beads, for removing false signal resulted from the conjugation of biotinilated liposomes through thiol group on their surface, was carried out via incubation with freshly prepared 4 Bovine serum albumin solution. The next step, the investigation of feasibility of proposed approach was approved with using excess amounts of thiolated and biotinilated probes and in the presence of 1 n and 10 p of target and the response had not linear relation with target concentration. In the following, the optimization of method was carried out via investigation of parameters including the amount of immobilized thiolated DNA probe on magnetic beads surface, the amount of magnetic beads, the amount of liposomes, the time of hybridization and the type of magnetic bead. Magnetic beads with cores of Fe3O4 have better perfarmance than megntic beads with cores of -Fe2O3. At optimized conditions, a semi logarithmic calibration curve between differential pulse voltammetric peak of released dopamine and the logarithm of concentration of target in the range of 1 fM to 1 nM with detection limit of 0.87 fM was obtained. The investigation of selectivity of developed method with oligonucleotide sequences without Poly (A)20 tail showed that the tailing of target is necessary and the proposed method showed that the the hybridization was not conducted in this situation. The lyophilized biotinilated dopamine-loaded liposomes were prepared using sucrose as cryoprotectant agent and then, they used successfully in proposed approach for detection of target oligonucleotide. A semi logarithmic calibration curve between differential pulse voltammetriy peak of released dopamine and the logarithm of concentration of target in the range of 0. 1 pM to 10 nM with detection limit of 17.06 fM was obtained.

محمودی بادکی، توحید

علی‌پور، اسماعیل، استاد راهنما

کریمی، افضل، استاد راهنما

گلابی، سید مهدی، استاد مشاور

همیشه‌کار، حامد، استاد مشاور

Public note

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی