عنوان

ارزیابی نقش G-CRE در مسیر هیدروکسی اوره درون کلونی های K562 ناک-این شده GFP به ژن Aگاما-گلوبین با استفاده از سیستم کریسپر Cas9

۳۲۹۰پ

فارسی

ارزیابی نقش G-CRE در مسیر هیدروکسی اوره درون کلونی های K562 ناک-این شده GFP به ژن Aگاما-گلوبین با استفاده از سیستم کریسپر Cas9

[پایان نامه]

Assessing the role of the G-CRE in the Hydroxyurea-pathway in GFP to Aγ-globin knock-in K562 clones by using the CRISPR/Cas9 system

دانشگاه علوم توان بخشی و سلامت اجتماعیUniversity of Social Welfare and Rehabilitation

۱۳۹۹

۱۰۵ص.

پیوست

19

6

۱۳۹۹/۰۸/۱۲

مقدمه: هموگلوبینوپاتی‌ها، مانند بتا-تالاسمی جزو رایج‌ترین بیماری‌های تک‌ژنی در سرتاسر جهان می‌باشند که به دلیل جهش در ژن بتا-گلوبین ایجاد می‌شوند. فعال‌سازی مجدد γ-گلوبین که در طی تکامل خاموش شده است، می‌تواند منجر به افزایش سطح هموگلوبین جنینی و کاهش علائم بتا-تالاسمی‌شود. داروی هیدروکسی‌اوره می‌تواند از طریق مسیر Ras/MAPK سبب افزایش بیان γ-گلوبین شود و برخی از عناصر ژنتیکی احتمالا در میزان پاسخ به این دارو نقش دارند.هدف: هدف مطالعه حاضر، ناک-این یک کاست EGFP در سلول K562 درون ژن Aγ-گلوبین از طریق سیستم CRISPR/Cas9 و ارزیابی بیان و میزان القاء هدفمند EGFP به وسیله داروی هیدروکسی‌اوره می‌باشد. در ادامه برای شناسایی تاثیر G-CRE بر میزان القاء هیدورکسی‌اوره 2 توالی G-CRE را به بالادست ژن Aγ-گلوبین وارد می‌نماییم. نهایتاً هدف کلی این مطالعه، ایجاد یک پلتفرم کارآمد برای بررسی تفاوت‌های القاء ژن‌های Aγ و Gγ-گلوبین و نقش عناصر فعال‌کننده سیس در پاسخ به داروی هیدورکسی‌اوره می‌باشد.روش اجرا: ابتدا توالی LHA مخصوص Aγ-گلوبین را با روش PCR در LHA-GFP-NeoR-RHA ایجاد کرده و سپس به منظور واردکردن G-CRE در LHA-GFP-NeoR-RHA از Overlap-PCR استفاده می‌کنیم. در ادامه کانستراکت‌های ساخته شده را به رده سلولی K562 ترانسفکت کرده و آنها را تحت انتخاب با آنتی بیوتیک پیرومایسین و G418 قرار می‌دهیم. در انتها نیز درستی ناک-این را با توالی‌یابی و بیان EGFP را با فلوسایتومتری قبل و پس از تیمار با هیدروکسی‌اوره مورد بررسی قرار می‌دهیم.یافته‌ها: کاست EGFP به‌صورت دقیق و اختصاصی وارد ژن Gγ-گلوبین شدند و بیان EGFP در جمعیت سلولی هدف شناسایی شد. در جمعیت سلولی GFP/Aγ -globin K562 knock-in فقط تعداد کمی از سلول‌ها EGFP را بیان می‌کردند (نشان‌دهنده وجود پس‌زمینه‌ای از سلول‌های ترانسفکت نشده می‌باشد) اما این میزان بیان به مقدار بسیار قابل‌توجهی بیشتر از سلول‌های GFP/Gγ -globin K562 knock-in بود.نتیجه‌گیری: این سیستم برای مطالعات در مقیاس ژنوم عناصر تنظیمی عمل‌کننده سیس که در بیان γ-گلوبین یا القاء توسط HU دخالت دارند، به‌راحتی قابل‌استفاده است.کلمات کلیدی: CRISPR/Cas9، γ-گلوبین، ناک-این، سلول‌های K562، G-CRE

Hemoglobinopathies, such as beta-thalassemia, are the most common single-gene diseases which are caused by mutations in the beta-globin gene. Reactivation of γ-globin, which is silenced during growth, can increase fetal hemoglobin levels and reduce the symptoms of beta-thalassemia. Hydroxyurea can increase γ-globin expression via the Ras/MAPK pathway, and some genetic elements may be involved in the response to this drug.The aim of the present study was to knock-in an EGFP cassette into the Aγ globin gene of K562 cells via the CRISPR/Cas9 system and to assess the expression and targeted induction of EGFP by hydroxyurea (HU). Next, to identify the effect of G-CRE (cAMP response element) on the induction of hydroxyurea, we sought insert two G-CRE sequences upstream of the Aγ globin gene. Finally, the overall aim of this study was to establish an efficient basis for assessing the differences in the induction of A-γ and G-γ globin genes and the role of cis-acting elements in the response to HU.First, we created the LHA sequence for Aγ globin by PCR in LHA-GFP-NeoR-RHA. We then use overlap-PCR to insert G-CRE into LHA-GFP-NeoR-RHA. Next, we transfect the created constructs into the K562 cell line and select them with puromycin and G418. Finally, we assessed the accuracy of the knock-in by sequencing and the expression of EGFP by flowcytometry before and after treatment with HU.EGFP cassettes were accurately and specifically inserted into the Aγ globin gene and EGFP expression was detected in the target cell population. In this cell population, only a small number of cells expressed EGFP (indicating a background of untransfected cells), but this expression was very significant.This system can be easily used for genome-scale studies of cis-acting regulatory elements involved in γ-globin expression or HU induction.Keyword: CRISPR / Cas9, γ-globin, Knock-in, K562 cells, G-CRE

CRISPR

حسنی، مهدی

Hasani, Mahdi

بنان، مهدی

نجم آبادی، حسین

ایران

دانشگاه علوم توان بخشی و سلامت اجتماعی

20211012

D

TF

279226

a

Y