۳۴۷۱پ
per
بررسی فعالیت ACC دآمیناز در ازتوباکترهای بومی و انتقال ژن acdS از سودوموناس فلورسنس به ازتوباکتر منتخب
/داود فرج زاده
: کشاورزی
، ۱۳۸۸
چاپی
کارشناسی ارشد
خاکشناسی - بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک
۱۳۸۸/۱۱/۱۳
تبریز
کلی یکی از مکانیسم‌صهای باکتری‌صهای ریزوسفری محرک رشد گیاه (PGPRs) برای تحریک رشد گیاهان از طریق فعالیت آنزیم۱ -آمینو سیکلوپروپان-۱-کربوکسیلیک اسید (ACC) دآمیناز می‌صباشد .باکتری-های حاوی این آنزیم، با تجزیه پیش ماده اتیلن گیاهی(ACC) ، غلظت آن را در گیاه در حال رشد و یا تحت تنش کاهش داده و در نتیجه گیاه را در مقابل اثرات مضر ناشی از سطوح بالای اتیلن) اتیلن تنشی (حفظ می‌صکنند .اگر چه بسیاری از گونه‌صهای ازتوباکتر رشد گیاهان را تحریک می‌صکنند، اما با وجود این، تاکنون گزارشی دال بر تولید آنزیم ACC دآمیناز توسط اعضای این جنس وجود ندارد .بنابراین، برای اثبات این موضوع در وهله اول، تعدادی از ایزوله‌صهای ازتوباکتر بومی از خاک‌صهای تحت کشت گندم و جو مناطق مختلف) محیطصهای تحت تنش خشکی و شوری (اطراف تبریز، جداسازی، خالص‌صسازی و شناسایی شدند و از نظر ACC دآمیناز بطریق بیوشیمیایی و مولکولی مورد بررسی قرار گرفتند .نتایج حاصله حاکی از عدم وجود و فعالیت آنزیم ACC دآمیناز در سویه‌صهای مورد مطالعه بود .بنابراین در وهله بعدی، به منظور ارتقا خصوصیاتPGPR ی ازتوباکتر، اقدام به انتقال ژن کدصکننده ACC دآمیناز (acdS) به سویه بومی منتخب ازتوباکتر گردید .برای انجام اینکار، ابتدا چندین سویه باکتری سودوموناس بومی با فعالیت ACC دآمینازی جداسازی و خالص‌صسازی گردید .سپس با استفاده از تکنیکPCR ، ژن acdS از یک سویه سودوموناس بومی با فعالیت ACC دآمینازی بالا (Pseudomonas fluorescens strain FY۳۲) تکثیر گردید .بررسی-های بیشتر نشان داد که این ژن جایگاه پلاسمیدی داشته و در یک پلاسمید مولکولی مورد بررسی قرار گرفتند .نتایج حاصله حاکی از عدم وجود و فعالیت آنزیم ACC دآمیناز در سویه‌صهای مورد مطالعه بود .بنابراین در وهله بعدی، به منظور ارتقا خصوصیاتPGPR ی ازتوباکتر، اقدام به انتقال ژن کدصکننده ACC دآمیناز (acdS) به سویه بومی منتخب ازتوباکتر گردید .برای انجام اینکار، ابتدا چندین سویه گردید .آنالیز ژنی به ترتیب ۹۴ و ۹۸ درصد شباهت در سطح اسید نوکلئیک و پروتئین با توالی acdS باکتری Pseudomonas sp. ۶G۵ نشان داد .همچنین، رسم درخت فیلوژنی توالی‌صهای acdS موجود و مقایسه آن با درخت فیلوژنی توالی‌صهای ۱۶S rRNA متناظر، حاکی از انتقال افقی ژن در داخل اعضای یک رده بود .سپس با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی BIAC F, AzbAcR و نیز BIAC F, R و pBKACC۱ بعنوان الگو، دو واکنش PCR دیگر انجام، و محصولات آن بترتیب در وکتورهایpBluescript II KS - و pBR۳۲۲ کلون شده قابلیت بیان ژن acdS را دارا بودند، ساخته شدند .به منظور بیان سیتوپلاسمی ژنacdS ، انتقال پلاسمید pBIACC به باکتری Azotobacter vinelandii FY۱۰ بومی منتخب از طریق الکتروپوریشن انجام شد .در ترانسفورمانت حاصله، بیان و فعالیت آنزیم ACC دآمیناز با روش اندازه‌صگیری کمی تائید شد .همچنین پایداری) بترتیب pBKACC۲ و pBRACC) و سپس در پلاسمیدهای)pET۲۸a + (و pBI۱۲۱ بترتیب تحت کنترل پروموترهای T۷ و CaMV ۳۵S ساب کلون گردیدند و نهایتا پلاسمیدهای نوترکیب pET۲۸ACC و pBIACC که پلاسمید انتقالی در باکتری نوترکیب حاصله طی ۱۰ کشت متوالی با کشت-های مکرر در محیط کشت‌صهای بدون آنتی‌صبیوتیک حاکی از پایداری بسیار بالای این پلاسمید بود .ارزیابی تاثیر تلقیح سویه باکتری تراریخت روی گیاه گندم حاکی از اثر مثبت و معنی‌صدار آن بر وزن تر ریشه و بخش هوایی بترتیب در مقایسه با سویه وحشی و شاهد بدون تلقیح بود .این اولین گزارش در مورد انتقال و بیان آنزیم ACC دآمیناز بعنوان یک خصوصیتPGPR ای دیگر ازتوباکتر می‌صباشد
and pBI121 under the control of the T7 and CaMV promoters, respectively. Finally the recombinant plasmids pET28ACC and pBIACC, capable of expressing acdS gene, were constructed. The pBIACC was transferred into indigenous Azotobacter vinelandii FY10 by electroporation. The expression of ACC deaminase was also proved in the transformants. We also showed that the recombinant plasmid is long lasting in Azotobacter vinelandii FY10 and can be stably replicated even in the tenth generation. The bacterial inoculation of wheat plants with the transformed bacterium had significantly positive effects on the root and shoot wet weigh in comparison to the wild type and control (non inoculated), respectively. Therefore, to the best of our knowledge this is the first report of ACC deaminase expression in Azotobacter as another PGPR property and pBR322 which resulted in recombinant plasmids pBKACC2 and pBRACC, respectively. Then the cloned fragments were subcloned in pET28a(- and then sequenced. Sequence analysis of the fragment showed that it was highly homologous (94 and 98 identities at nucleotide and amino acid levels, respectively) to the previously characterized acdS gene from Pseudomonas sp. 6G5. In addition, a phylogenetic tree based on coding region complete sequences of all known ACC deaminase genes and its comparison with their corresponding 16S rRNA tree, suggested occurrence of horizontal transfer of these genes within members belonging to the same taxonomic class. Two other PCR reactions were done using two primer pairs AzbAcR, BIACF and BIAC F, R and pBKACC1 as the template. The PCR products were cloned in pBluescript II KS- encoded nature of the gene. Hence, transferring pFY32 into E. coli DH5 provided further support. The amplified acdS was cloned in pBluescript II KS-encoded so that a large plasmid (pFY32) with about 50 kbp in size was identified from this bacterium. The identical restriction patterns of the products (acdS gene) resulting from PCR on total DNA extraction from Pseudomonas fluorescens FY32 or on the plasmid (pFY32) preparation alone gave another evidence as to the plasmid- affected soils) in Tabriz, subjected to purification and identification. Then the azotobacteria isolates were assayed by biochemical and molecular approaches to find out their ability to produce ACC deaminase. The results revealed that none of the studied isolates contain ACC deaminase activity. Therefore, as part of an effort to obtain an ACC deaminase encoding Azotobacter, some ACC deaminase containing Pseudomonades were isolated and purified. Then, acdS gene was amplified from FY32 strain of Pseudomonas fluorescens which has high ACC deaminase activity. In addition, further analyses revealed that the acdS was plasmid- and salt-Abstract:ACC deamination is one of the mechanisms that soil bacteria use to stimulate growth of plants. ACC deaminase containing bacteria can cleave the ethylene precursor ACC and thereby lower the level of ethylene in developing or stressed plants and protect plants from the deleterious effects due to high level of ethylene. However, despite considerable amount of experimental data concerning azotobacteria simulation of plant development, evidence to indicate that members of Azotobacter genus are able to produce ACC deaminase so far has not been provided. So, in this study, some indigenous azotobacteria were isolated from rhizosphere soils of wheat and barley plants cultivated in different areas (drought )
ACC deaminase
cloning
Pseudomonas fluorescens FY32
electroporation
Azotobacter vinelandii FY10
gene transformation
فرج زاده، داود
یخچالی، باقر، استادراهنما
علی‌اصغرزاد، ناصر، استدراهنما
سخندان بشیر، نعمت، استادمشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
