۲۰۵۴پ
per
انتقال ژن cry۳A به یونجه (.(Medicago sativa L برای ایجاد مقاومت به سرخرطومی یونجه (.(Hypera postica Gyll به کمک اگروباکتریوم
/ناصر زارع
: کشاورزی
۱۴۳ ص، جدول، نمودار، عکس، لوح فشرده
چاپی
واژه نامه بصورت زیرنویس
کتابنامه ص.: ۱۳۱-۱۴۳
دکتری
اصلاح نباتات
۱۳۸۸/۰۸/۱۱
تبریز
یونجه (.(Medicago sativa L یکی از گیاهان علوفهای مهم است که به خاطر داشتن پروتئین و ارزش غذایی بالا نقش بسزایی در تغذیه دام دارد .علیرغم فعالیت‌های مدیریتی بهتر، امروزه آفات بخش قابل توجهی از محصولات کشاورزی ( (۱۳ را از بین برده و باعث کاهش کیفیت محصول می‌شوند .علاوه بر این، سموم مورد استفاده برای کنترل آفات دارای اثرات نامطلوبی بر سلامت انسان و محیط زیست هستند .سرخرطومی یونجه (.(Hypera postica Gyll آفت مهم یونجه در ایران و جهان است و در ایران خسارت ناشی از این آفت ۳۳ برآورد شده است .این تحقیق به منظور انتقال ژن cry۳A به یونجه برای ایجاد مقاومت به آفت سرخرطومی صورت گرفت .با توجه به اینکه اولین گام برای دستکاری ژنتیکی این گیاه، بهینه‌سازی یک سیستم موثر باززایی درون‌شیشه‌ای و بدست آوردن ژنوتیپ‌هایی با قابلیت باززایی بالا است، ابتدا پاسخ جنین‌زایی دو جداکشت برگ و دمبرگ پنج رقم یونجه ایرانی با استفاده از شش پروتکل مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت .با دو پروتکل IV و VI هر دو جداکشت برگ و دمبرگ کالوس‌های حاوی جنین سوماتیکی تولید کردند .درصد جنین‌زایی و تعداد جنین در جداکشت بسته به ژنوتیپ، پروتکل و جداکشت مورد استفاده به ترتیب از صفر تا ۱۲ درصد و صفر تا ۵/۱۶ عدد متغیر بود .به منظور گزینش ژنوتیپ‌های دارای قابلیت جنین‌زایی بالا، پاسخ جنین‌زایی۲۱ - ۲۹ژنوتیپ) گیاه (از هر پنج رقم با استفاده از پروتکل VI مورد ارزیابی قرار گرفت .به طور کلی، ۵/۱۰ درصد از ژنوتیپ‌های مورد ارزیابی قابلیت جنین‌زایی سوماتیکی را داشتند و سه ژنوتیپ قره یونجه-مراغه-۲۷)-۲۷ (Km، قره یونجه-قره‌قزلو-۱۴) -۱۴ (Kkو سینتتیک-۱۸) -۱۸ (Synکه قابلیت باززایی بالایی نسبت به بقیه داشتند برای مطالعه بیشتر و بهینه سازی انتقال ژن انتخاب شدند .در این تحقیق، ژن cry۳A با استفاده از فناوری DNA نوترکیب در ناقل بیانی گیاهی pBI۱۲۱ تحت راه‌انداز CaMV ۳۵S و خاتمه‌دهنده nos قرار گرفت و برای انتقال به ژنوتیپ‌های گزینش شده یونجه مورد استفاده قرار گرفت .برای این منظور پاسخ تراریختی دو جداکشت برگ و دمبرگ سه ژنوتیپ گزینش شده به سه سویه اگروباکتریLBA۴۴۰۴ ، AGL۰۱ و GV۳۱۰۱ با زمان‌های مختلف هم‌کشتی و حضور استوسیرینگون در سوسپانسیون تلقیح مورد ارزیابی قرار گرفت .تعداد ۲۱ جداکشت از جداکشت‌های مربوط به چهار و هشت روز هم‌کشتی، جنین‌های سوماتیکی مقاوم به کانامایسین تولید کردند که همه این جداکشت‌ها متعلق به ژنوتیپ‌های۲۷ - Kmو۱۴ - Kkتلقیح شده با سویه‌های LBA۴۴۰۴ و AGL۰۱ بودند .متوسط کارایی تراریختی دو جداکشت از دو ژنوتیپ۲۷ -Kmو۱۴ - Kkبا سویه‌های LBA۴۴۰۴ و AGL۰۱ بر اساس تعداد گیاهان مقاوم به کانامایسین برابر ۲۱/۱ درصد بود .کارآیی تراریختی سویه‌های اگروباکتریوم مورد استفاده متفاوت و فراوانی تراریختی) درصد جداکشت‌های حاوی جنین‌های سوماتیکی مقاوم به کانامایسین (حاصل از سویه LBA۴۴۰۴ بیشتر از دو سویه دیگر بود .تجزیه PCR با آغازگرهای اختصاصی ژنcry۳A ، حضور تراژن در ۸۵ گیاهان مقاوم به کانامایسین را نشان داد .بررسی دورگ‌سازی سادرن در یکی از لاین‌های تراریخت نیز نشان داد که ژن cry۳A در ژنوم این لاین در سه جایگاه مختلف تلفیق شده است .تجزیه لاین‌های تراریخت با استفاده از روش داس الایزا، بیان پروتئین Cry۳A در برگ گیاهان تراریخت را نشان داد .زیست سنجی گیاهان تراریخت با آفت سرخرطومی یونجه نشان داد که مقاومت لاین‌های تراریخت در برابر این آفت افزایش یافته است.
Alfalfa is one of the most important forage crops and is suitable for animal feeding because of its high level of protein content. Despite of modern management efforts, insects reduce the amount (13 ) and quality of agriculture products. Furthermore, application of insecticides in pest management has undesirable effects on environmental and human- health. The alfalfa weevil is a major pest of alfalfa and causes about 33 yield reduction in Iran. The aim of this study was to transform alfalfa with cry3A gene for production of alfalfa weevil resistant plants. Optimization of an effective in vitro regeneration system and selection of regenerable genotypes are the prerequisites for genetic manipulation of alfalfa. Therefore, embryogenesis response of leaf and petiole explants of five Iranian alfalfa cultivars was evaluated using six regeneration protocols. Using protocols IV and VI, the both explants produced somatic embryos on calli. The percentage of embryogenesis and the number of embryos per callus varied from 0 to 12 and 0 to 16.5, respectively, depending on the genotype, protocol and explant. For selection of genotypes with high regeneration capability, embryogenesis response of 21-29 genotypes (plants) from each cultivars were evaluated using protocol VI. About 10.5 percent of tested genotypes had regeneration ability and three of them namely, 'Kara yonje- Maraghe'- 27 (Km-27), 'Kara yonje- Karakozlu'-14 (Kk-14) and 'Synthetic'- 18 (Syn-18) exhibited high capability of regeneration. In this study, the cry3A gene was cloned into pBI121, plant expression vector, under CaMV35S promoter and nos terminator and transferred to the selected alfalfa genotypes. For this purpose, transformation response of two kind of explants from three selected alfalfa genotypes were evaluated by using LBA4404, AGL01 and GV3101 strains of Agrobacterium. The effects of different co-cultivation periods and the presence of acetosyringon in bacterial infection suspension were tested. Twenty-one explants from two Km-27 and Kk-14 genotypes infected with LBA4404 and AGL01 strains produced kanamycin resistant somatic embryos. Averaged over the two LBA4404 and AGL01 strains, transformation efficiency of leaf and petiole explants from two Km-27 and Kk-14 genotypes was 1.21 . Transformation frequencies obtained from three strains of Agrobacterium were different and the percentage of explants produced kanamycin resistant embryo in cocultivation with LBA4404 strain was higher than other strains. PCR analysis using cry3A specific primers confirmed the presence of transgene in 85 of kanamycin resistant plants. Integration of cry3A gene into the alfalfa genome was confirmed by southern blot analysis. Analysis of transgenic alfalfa lines using DAS ELISA technique showed the expression of Cry3A protein in these lines. Bioassay of transgenic plants with alfalfa weevil showed enhanced resistant against this pest.
Agrobacterium tumefaciense
Alfalfa Transformation
cry3A gene
Resistance to alfalfa weevil
زارع، ناصر
ولیزاده، مصطفی، استاد راهنما
توحید فر، مسعود، استاد راهنمای همکار
محمدی، سیدابوالقاسم، استاد مشاور
حبشی، علی اکبر، استاد مشاور همکار
ملبوبی، محمدعلی، استاد مشاور همکار
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
