پ۲۹۷۵۳
per
ارزیابی تاثیرات سرکوب ژن گلوتامین سنتتاز بر ویژگی های تکثیر، مهاجرت و مرگ سلولی در رده سلولی MCF7
آرزو کریم پور زحمت کش
علوم طبیعی
۱۴۰۲
۱۱۲ص.
سی دی
دکتری
ژنتیک مولکولی
۱۴۰۲/۰۶/۲۶
مقدمه: مسیر آنزیم گلوتامین سنتتاز یکی از مسیرهای متابولیک مهم در سلول های لومینال سرطان پستان است که نقش مهمی در تامین گلوتامین مورد نیاز این سلول ها، به عنوان یکی از ترکیبات واسطه در بیوسنتز اسیدهای آمینه و نوکلئوتیدها ایفا می کند. در مقابل گلیکولیز و گلوکز به عنوان سوبسترای اصلی این مسیر، از جمله اصلی ترین اجزای متابولیسم در سلول های سرطانی در نظر گرفته می شوند. با در نظر گرفتن اهمیت این دو مسیر متابولیک، هدف قرار دادن توام آن ها در مدیریت رشد و تکثیر سلول های لومینال سرطان پستان احتمالا موثرتر از هدف گیری هر کدام از مسیرها به تنهایی است. مواد و روش ها: به این منظور سلول های MCF7 در محیط های کشت DMEM با سطوح متفاوت گلوکز به ترتیب دارای 4.5، 2 و 1 گرم بر لیتر کشت داده شده و مطالعات بیان ژنی در ارتباط با ژن های GLUL (glutamine synthetase) ، GSTM3 (glutathione s transferase Mu3) و ENO1 (alfa enolase 1)، نیز ارزیابی فازهای چرخه سلولی با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری انجام گردید. با توجه به نتایج حاصل، ترانسفکشن siRNA بر علیه رونوشت های ژن GLUL در سلول های کشت داده شده در محیط های کشت با گلوکز بالا و پایین با غلظت 220 پیکومول از siRNA انجام گردیده و بیان ژن GLUL بعد از 48 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. با توجه به نتایج حاصل از این مرحله، محیط کشت با گلوکز پایین در جهت اجرای مطالعات تکمیلی و بررسی تغییرات تکثیر، مهاجرت و آپوپتوز سلولی در سلول های کنترل و ترانسفکت شده به کار گرفته شدند. به این منظور از تکنیک های بررسی بیان ژنی شامل qRT PCR و وسترن بلاتینگ، تکنیک wound healing assay برای مطالعه تغییرات سرعت مهاجرت و در نتیجه متاستاز سلولی و تکنیک فلوسیتومتری در جهت مطالعه فازهای چرخه سلولی و آپوپتوز سلولی و از تکنیک رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید/ آکریدین اورنج در جهت بررسی مورفولوژیک آپوپتوز بهره برده شد. نتایج: بر طبق نتایج به دست آمده، میزان بیان ژن گلوتامین سنتتاز با میزان گلوکز موجود در محیط نسبت مستقیم دارد. به این ترتیب در محیط های با گلوکز پایین میزان بیان ژن GLUL کاهش نشان می دهد. در بررسی فازهای چرخه سلولی افزایش گلوکز موجود در محیط با افزایش تعداد سلول ها در فاز تکثیری G2-M که این تعداد با کاهش گلوکز کاهش یافته (P<0.0001) و در صورت توام شدن آن (گلوکز پایین در محیط کشت) با سرکوب ژنی GLUL به حداقل خود می رسد. هم چنین سرکوب ژنی GLUL با کاهش بیان ژن GSTM3 (p=0.0013) و افزایش سلول های آپوپتوتیک همراه می گردد. ژن GSTM3 کد کننده آنزیم گلوتاتیون s ترانسفراز Mu3 به عنوان یکی از اعضای خانواده آنزیم های دتوکسیفیکاسیون فاز II است. نقش اصلی آنزیم های این خانواده در سم زدائی ترکیبات دارویی و ROS (گونه های باز واکنش گر اکسیژن مثل H2O2 و ...) ها می باشد. طبیعتا با کاهش بیان این ژن رویارویی سلول ها با ROS بیش تر شده و مرگ سلولی را سبب می شود. با در نظر گرفتن نقش گلوتامین در مسیر تولید گلوتاتیون، کاهش تولید این اسید آمینه با کاهش تولید گلوتاتیون به عنوان کوفاکتور اصلی آنزیم GST3M و در نتیجه افزایش هر چه بیش تر ROS های محیط همراه خواهد بود. علاوه بر این با توجه به تاثیر مثبت گلیکولیز هوازی در تولید اسید لاکتیک و مقابله با ROS های موجود در محیط، کاهش گلوکز موجود در محیط با افزایش مواجهه سلولی با ROS و افزایش مرگ سلولی همراه خواهد بود. با توجه به این توضیحات مکانیسم احتمالی موثر در پیش برد آپوپتوز سلول های مورد آزمون، تجمع ROS در محیط رشدی سلول می باشد. هم چنین در این مطالعه بیان ژن پروآپوپتوتیک Bax نیز افزایش نشان می دهد که خود یکی از ژن های موثر در مسیر داخلی آپوپتوز می باشد. بر اساس نتایج حاصل از مطالعات این افزایش بیان قابل انتساب به تضعیف احتمالی مسیر mTOR/AKT به دنبال سرکوب ژن GLUL می باشد که می تواند به عنوان یکی از عوامل موثر در افزایش آپوپتوز سلولی در نظر گرفته شود. به این ترتیب هدف گیری دو مسیر گلیکولیز و گلوتامین سنتتاز به عنوان یک استراتژی درمانی نوین چند وجهی (multi modal) در مدیریت سرطان لومینال سرطان پستان در نظر گرفته شود.
Abstract: The glutamine synthetase path is one of the most important metabolic pathways in luminal breast cancer cells, which plays a critical role in supplying glutamine as an intermediate in the biosynthesis of amino acids and nucleotides. On the other hand, glycolysis and its dominant substrate, glucose, are the most critical players in cancer metabolism. Accordingly, targeting these two critical paths might be more efficient in luminal-type breast cancer treatment. MCF7 cells were cultivated in media containing 4.5, 2, and 1 g/L glucose to study its effects on GLUL (Glutamate Ammonia Ligase or glutamine synthetase), GSTM3 (glutathione s transferase Mu3) and ENO1 (alfa enolase 1) expression. The cell cycle phases were evaluated using flowcytometery technique. Followingly, high and low glucose cell cultures were transfected with 220 pM of siGLUL and incubated for 48 h at 37 ºC and the expression of GLUL was studied. Regarding the result, low glucose medium was selected as main gowth media for further studies. Two groups of cells including control and transfected cells were investigated using western bloting, wound healing assay, cell cycle and appotosis flowcytometry assay. Also, ethidum bromide/ acridine orange staining was used to study live and apoptotic cell morphologic changes. To examine the migration and invasion capacity of studied cells exploited from wound healing assay and subsequent expression studies of GSTM3 and ENO1. Expression of GLUL significantly decreased in cells cultured at lower glucose levels compared to those at higher glucose levels. Flowcytometric studies of cell cycle indicated increased G2-M phases in high glucose cultures compared to low cultures (P<0.0001). Based on the results, GLUL suppression down-regulated GSTM3 (p=0.0013), a main detoxifying enzyme, and up-regulated Bax. According to the role of glycolysis as a ROS suppressor, decreased amounts of glucose could be associated with increased ROS. On the other hand, down regulation of GSTM3 and deacresed glutathione produce could cause ROS accumulation in the growth environment of MCF7 cells. Based on these resons ROS could be considered as an efficient involved cause of increased cell death in this study. Also, increased expression of Bax, other possible cause of increased apoptosis, could be attributable to mTOR/AKT inhibition following GLUL repression. In conclusion, utilizing GLUL and glycolysis inhibitors might be a more effective strategy in luminal-type breast cancer therapy.
Evaluation of the effects of glutamine synthetase gene knockdown on the proliferation, migration and apoptosis in the MCF7 cell line
کریم پور زحمت کش،
آرزو
تهیه کننده
خلج کندری،
حسین پور فیضی،
برادران،
محمد
محمدعلی
بهزاد
استاد راهنما
استاد مشاور
استاد مشاور
تبریز
