عنوان

ساخت و بررسی داربست نانوفایبری حاوی سیلیبینین بر تکثیر و حفظ بنیادینگی سلول¬های بنیادی مزانشیمی با هدف استفاده در پزشکی بازساختی

۲۹۲۰۸

per

ساخت و بررسی داربست نانوفایبری حاوی سیلیبینین بر تکثیر و حفظ بنیادینگی سلول¬های بنیادی مزانشیمی با هدف استفاده در پزشکی بازساختی

زهرا احمدزاده

دامپزشکی

۱۳۹۸

۱۲۰ص.

سی دی

کارشناسی ارشد

علوم درمانگاهی

۱۳۹۸/۱۱/۲۰

پزشکی باز ساختی به عنوان یکی از مهمترین مباحث پژوهشی برای ایجاد ترمیم در بدن، از ژن و سلول و به خصوص سلولهای بنیادی برای جبران سلولهای از دست رفته بافتی استفاده می کند.سلولهای بنیادی قویترین ابزارطب ترمیمی به شمار می روند. این سلولها، بافتها و ارگانهای آسیب دیده را در فرآیند ترمیم تقویت می پکنند. سلولهای بنیادی مزانشیمی به خاطر خصوصیاتی نظیر تمایز، توانایی تکثیر و خود نوسازی طولانی جهت استفاده در سلول درمانی توجه زیادی را به خود جلب کرده اند. علاوه بر این مطالعات نشان داده که استرس اکسیداتیو و التهابی ناحیه آسیب بطور موثری می¬توانند نرخ بقای این سلولها را حین پیوند زدن کاهش دهد. تولید رادیکالهای آزاد درروند پیری موثر است و بنظر می¬رسدکه استفاده از ترکیباتی با خواص آنتی اکسیدانی و ضدپیری با خنثی سازی رادیکالهای آزاد می¬تواند به جلوگیری از روند پیری این سلولها کمک شایانی نماید. در مطالعه پیشرو قصد داریم تا با ساخت و ارزیابی داربست¬های نانوفایبری مبتنی بر سیلیبینین، تاثیر آنها را بر روی روند تکثیر و حفظ حالت بنیادینگی سلولهای بنیادی مزانشیمی بررسی نماییم. با این امیدواری که کشت سلولهای بنیادی بر روی چنین داربستهای بیواکتیوی منجر به ازدیاد سلولهای بنیادی در مقیاس بزرگتر شده و میزان کافی از آنها را برای اهداف پزشکی بازساختی فراهم نماید.روش کار: پلیمرهای طبیعی و یا سنتتیک زیست تخریب پذیرجهت تهیه ماتریس نانوفایبری بکار گرفته می شوند. غلظتهای مختلف سیلیبینین بصورت قطره وار به محلول پلیمری کلاژن تیپ یک به دقت اضافه شده و برای یک ساعت قبل از الکترواسپینینگ در حالت استرینگ نگهداری شد. یک ولتاژ بالا برابر با 25-30 کیلو ولت برای انجام الکترواسپینینگ نانوفایبرها بکار گرفته شد. دو نوع ماتریس نانوفایبری سنتز شد که شامل پلیمر همراه با سیلیبینین و پلیمر بدون سیلیبینین._پمورفولوژی ، ضخامت وتوپولوژی نانوفیبرها توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی (FE-SEM) وAFM مورد مطالعه قرار گرفت._ پیکربندی دید شیمیایی داربست حاوی سیلیبینین از طریق FTIR بدست آمد. تعیین میزان نرخ تخریب ، جذب آب وتست نفوذ پذیری به بخار آب WVPدرداربستهای نانو لیفی ومقایسه آنها در بازه زمانی مشخص، برای کارآمدی بالقوه داربست¬ها دردرمان جراحات به عنوان پانسمان زخم بررسی ¬شد._ استحکام کششی نانوالیاف از طریق UTM و بررسی ساختار بلوری داربست¬ها به روش XRD مطالعه شد.هدف دوم: برای تعیین میزان تکثیر سلولهای بنیادی بر روی داربست¬های حاوی سیلیبینین سلولهای بنیادی مزانشیمال مشتق از بافت آدیپوز خریداری شده از بانک سلولی انیستیتو پاستور دفریز شده و در فلاسک کشت بافت 25 cm و 75 در DMEM بهمراه 10 % FBS و یک درصدآنتی بیوتیک در پاساژهای مختلف کشت -شد.mm 15 از نانوفیبرهای تهیه شده در پلیت¬های 24 - well قرار داده ¬شد. با UV استریلیزه و سه بار با PBS شستشو شد، سپس بصورت اورنایت قبل ازافزودن سلولها، با DMEM انکوبه شدند. MSC ها پس از confluency، با تریپسین جدا شده و با استفاده از رنگ تریپان بلو و با بکارگیری لام هموسیتومتر شمارش شدند. سپس روی داربستها با دانسیته 2000 سلول در هر ویال افزوده شد. پس از 48 ساعت، میزان زنده¬مانی سلولها بر روی داربست¬های نانوفایبری حاوی پلیمر به تنهایی و پلیمر به¬همراه سیلیبینین و همچنین پلیت¬های کشت بافتی (TCP) با بکارگیری آنالیز MTT سنجیده شده، باهم مقایسه گردید. نتایج: در این مطالعه، نانوالیاف پلی کاپرولاکتون/ کلاژن مبتنی بر سیلیبینین از طریق روش الکترواسپینینگ سنتز گردید و سپس ویژگی های موروفولوژیکی از طریق SEM وAFMوپیکربندی شیمیایی آن از طریق FTIR توصیف شد. نتایج آشکار کردند که این نانوالیاف دارای موروفولورژی یکنواخت، تصادفی با سطوح تا حدودی صاف بصورت یک شبکه در هم تنیده بودند. افزودن دارو باعث افزایش زبری وبارگذاری همگن شده همچنین گروه های عاملی مورد انتظار مشاهده شد. خواص مکانیکی از طریق UTM، XRD، WVP، Swelling، WeigthingLoss بررسی شد. نتایج نشان می¬دهد بعداز لود دارو مقاومت داربست¬ها افزایش یافت، ساختار بلورینگی حفظ شد، میزان جذب آب و تخریب در بازه زمانی مشخص افزایش یافته ومیزان نفوذپذیری به بخارآب افزایش یکنواخت نشان داد. تست¬های آزمایشگاهی با بکارگیری سلولهای بنیادی مشتق از بافت آدیپوز، ضمن نگهداری ویژگی¬های بنیادینگی این سلولها، زیست سازگاری بالای این نانوساختارها را برای بهبود چسبندگی و تکثیر سلولی تایید نمودند. پس از لود دارو افزایش معنی دار دررشد مشاهده نشد ولی عدم سمیت دارو تایید می شود. نتایج تست اثرحفاظت سلولی خواص آنتی اکسیدانی دارو را نشان می دهد. نتیجه گیری: فاکتورهای فیزیکوشیمیایی مناسب داربست های تهیه شده و با بکارگیری سلولهای بنیادی مشتق از بافت آدیپوز، ضمن نگهداری ویژگی-های بنیادینگی این سلولها، زیست¬سازگاری بالای این نانوساختارها را برای بهبود چسبندگی و تکثیر سلولی تایید نمودند. چنین یافته¬هایی پتانسیل امیدبخشی برای بکارگیری داربستهای نانولیفی مبتنی بر مواد طبیعی در شاخه مهندسی بافت و همینطور در درمانهای بازساختی ارائه می کنند.

Regenerative medicine, as one of the most important research topics to create restoration in the body, uses genes and cells, especially stem cells, to¬ compensate for lost tissue cells. Stem cells are the most powerful regenerative medicine tools. These cells strengthen the damaged tissues and organs in the healing process. Mesenchymal stem cells have attracted a lot of attention due to their characteristics such as differentiation, ability to reproduce and long-term self-renewal for use in cell therapy. In addition, these studies have shown that oxidative and inflammatory stress in the injury area can effectively reduce the survival rate of these cells during transplantation. The production of free radicals is effective in the aging process and it seems that the use of compounds with antioxidant and anti-aging properties by neutralizing free radicals can help prevent the aging process of these cells. In the upcoming study, we intend to investigate the effect of silibinin-based nanofibrous scaffolds on the proliferation and maintenance of the stemness of mesenchymal stem cells. With the hope that the cultivation of stem cells on such bioactive scaffolds will lead to the proliferation of stem cells on a larger scale and provide a sufficient amount of them for regenerative medicine purposes. Method: Biodegradable natural or synthetic polymers are used to prepare nanofiber matrix. Different concentrations of silibinin were carefully added dropwise to collagen type 1 polymer solution and kept in string mode for one hour before electrospinning. A high voltage of 25-30 kV was used to perform electrospinning of nanofibers. Two types of nanofiber matrix were synthesized, including polymer with silibinin and polymer without silibinin. The morphology, thickness and topology of nanofibers were studied by scanning electron microscope (FE-SEM) and AFM.The configuration of the chemical vision of the silibinin-containing scaffold was obtained through FTIR. Determining the degradation rate, water absorption and water vapor permeability test of WVP in nano-fibrous scaffolds and comparing them in a certain time frame were investigated for the potential efficiency of scaffolds in treating wounds as wound dressings. The tensile strength of nanofibers was studied through UTM and the crystal structure of scaffolds was studied by XRD method. The second objective: to determine the proliferation rate of stem cells on scaffolds containing silibinin, mesenchymal stem cells derived from adipose tissue purchased from the Pasteur Institute cell bank, and frozen in 25 cm and 75 cm tissue culture flasks in DMEM with 10% FBS and 1% antibiotics. Cultivated in different passages. 15 mm of prepared nanofibers were placed in 24-well plates. It was sterilized by UV and washed three times with PBS, then overnight before adding cells, they were incubated with DMEM. After confluency, MSCs were isolated with trypsin and counted using trypan blue dye and hemocytometer slides. Then, 2000 cells per vial were added to the scaffolds. After 48 hours, the viability of cells on nanofiber scaffolds containing polymer alone and polymer together with silibinin as well as tissue culture plates (TCP) were compared by using MTT analysis. Results: In this study, silibinin-based PCL-COLLAGEN nanofibers were synthesized through electrospinning method, and then their morphological characteristics were described through SEM and AFM, and their chemical structure was described through FTIR. The results revealed that these nanofibers had a uniform, random morphology with somewhat smooth surfaces and were interwoven in a network. Addition of drug increased roughness and homogenous loading, as well as expected functional groups were observed. Mechanical properties were investigated through UTM, XRD, WVP, Swelling, WeighthingLoss. The results show that after drug loading, the strength of the scaffolds increased, the crystalline structure was maintained, the amount of water absorption and degradation increased in a certain period of time, and the permeability to water vapor showed a uniform increase. Laboratory tests using stem cells derived from adipose tissue, while maintaining the basic characteristics of these cells, confirmed the high biocompatibility of these nanostructures to improve cell adhesion and proliferation. After drug loading, no significant increase in growth was observed, but the non-toxicity of the drug is confirmed. The results of the cell protection effect test show the antioxidant properties of the drug. Conclusion: The appropriate physicochemical factors of the scaffolds were prepared and by using stem cells derived from adipose tissue, while maintaining the stemness characteristics of these cells, they confirmed the high biocompatibility of these nanostructures to improve cell adhesion and proliferation. Such findings provide a promising potential for the use of nanofibrous scaffolds based on natural materials in the field of tissue engineering as well as in regenerative therapies.

Development of Silibinin based nanofirous for proliferation and stemness preservation of mesenchymal stemcells:possible application in regenerative medicine

احمدزاده،

زهرا‏

تهیه کننده

‏جعفری جوزانی،

ضرغامی،

‏رضی اله

‏نصراله

استاد راهنما

استاد راهنما

تبریز