پ۲۸۸۲۹
per
بررسی تاثیر knock down ژن SLC9A5 بر توانایی رشد و مهاجرت رده ی سلولی SW-480 سرطان کولورکتال
بهناز برقیان زرنقی
علوم طبیعی
۱۴۰۱
۶۶ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
زیست شناسی سلولی و مولکولی
۱۴۰۱/۰۶/۲۰
سومین سرطان شایع در دنیا سرطان کولون میباشد، بطوریکه در ایالات متحده درصد بالایی از مرگ و میر را به خود اختصاص داده است. فرآیند بیماری¬زایی در سرطان روده، پيچيده و چند عاملي است و ژن¬های متعددی در پيشرفت و گسترش این نوع سرطان دخالت دارند. ناقلین حامل املاح (SLC)، دومین خانواده بزرگ پروتئین¬های غشایی در سلول¬های انسانی هستند که انتقال طیف وسیعی از مواد را از طریق غشاهای بیولوژیکی تسهیل می¬کنند و نقش مهمی در فرایندهای فیزیولوژیکی شامل جذب سلولی مواد مغذی تا جذب داروها و سایر زنوبیوتیک¬ها دارند. اگزالی¬پلاتین داروی نسل سوم پلاتینوم ضدسرطان، جهت درمان سرطان کولون پیشرفته استفاده می¬شود. این دارو به واسطه از بین بردن سلول¬های سرطانی و کند کردن رشد تومور عمل می¬کند اما مکانیسم دقیق مرگ سلول¬های سرطانی به طور کامل مشخص نیست. ژن SLC9A5 با تنظیم pH سیتوزولی در از بین بردن اسیدهای تولید شده توسط متابولیسم فعال و مقابله با شرایط نامساعد محیطی دخیل است. یک سلول سرطانی برای تثبیت موقعیت خود باید متابولیسم سلول را به نفع خود تغییر دهد که شامل تغییر در متابولیسم کربوهیدرات¬ها است. تحقیقات نشان می¬دهد که اولین و مهمترین تغییر در متابولیسم سلول سرطانی، تغییر در متابولیسم قند¬ها است که از متابولیسم هوازی به متابولیسم بی هوازی تغییر می¬یابد. محصول متابولیسم بی هوازی گلوکز، اسیدلاکتیک است. اسیدلاکتیک باعث می¬شود تا pH سلول سرطانی از سلول سالم پایین¬تر و به عبارت دیگر اسیدی¬تر شود. در نتیجه ناقل NHE5 که توسط ژن SLC9A5 کد می¬شود، با انتقال یون +H به محیط بیرونی سلول، ازطریق ایجاد شرایط اسیدی در ریز محیط تومور، موجب تهاجم، پیشرفت و مقاومت در برابر درمان¬های سرطان می¬شود. هدف این پژوهش، بررسی تاثیر سرکوب ژن SLC9A5 بر میزان بقا و رشد و مهاجرت سلول¬ها در رده¬ی سلول سرطان روده بزرگ SW-480 بود. در این مطالعه، سلول¬های سرطانی کولورکتال (SW-480) در محیط RPMI-1640 حاوی 10% FBS و 1% آنتی بیوتیک Pen-strep کشت داده شد و ترانسفکشن وکتور پلاسمیدی کدکننده SLC9A5 (pRNA-SLC9A5) انجام گرفت. جهت بررسی تاثیر ناک داون SLC9A5بر بقای سلول-های سرطانی کولورکتال، از آزمون ریزکشت ﺗﺘﺮازوﻟﯿﻮم (MTT) استفاده شد. همچنین مهاجرت سلول¬های سرطانی ترانسفکت شده با استفاده از تست Scratch مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، تاثیر ناک داون SLC9A5بر روی القای آپوپتوز سلول¬های سرطانی کولورکتال با استفاده از روش فلوسایتومتری و به دنبال آن تاثیر ناک داون SLC9A5بر روی چرخه سلولی سلول¬های سرطانی کولورکتال با استفاده از روش فلوسایتومتری ارزیابی شد. در نهایت بیان نسبی ژن¬های مختلف درگیر در ایجاد و پیشرفت سرطان (SLC9A5، BAX، BCL2، CASPASES3، CASPASES8، CASPASES9) با استفاده از روش qRT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. داده¬های حاصل از qRT-PCR در گروه¬های کنترل و تیمار مقایسه شد و تفاوت بیان ژن¬های مورد مطالعه مشخص گردید. یافته¬های حاصل از تست MTT نشان داد که سرکوب ژن SLC9A5 به همراه تیمار با اگزالی¬پلاتین موجب کاهش بقای سلول¬های سرطانی می¬شود. بر اساس نتایج این مطالعه سرکوب ژن SLC9A5 به همراه تیمار با اگزالی¬پلاتین موجب مهار مهاجرت و متاستاز سلول¬های سرطانی کولورکتال می¬شود. آنالیز فلوسایتومتری نشان داد که میزان آپوپتوز سلول¬های سرطانی در پی ترنسفکشن به همراه تیمار با اگزالی¬پلاتین بطور قابل توجهی افزایش می¬یابد. همچنین نتایج به دست آمده از بررسی چرخه سلولی سلول¬های سرطانی توسط فلوسایتومتری نشان داد که تعداد سلول¬هایی که در مرحله G0 متوقف شده¬اند، درگروه سلول-های سرطانی ترنسفکت شده به همراه تیمار با اگزالی¬پلاتین بطور چشمگیری افزایش می¬یابد. بر اساس نتایج بررسی بیان ژن¬های درگیر در سرطان (SLC9A5، BAX، BCL2، CASPASES3، CASPASES8، CASPASES9)، سرکوب ژن SLC9A5 به همراه تیمار با اگزالی¬پلاتین از طریق مکانیسم های مختلف مولکولی همچون القاء آپوپتوز موجب مهار رشد و تکثیر سلول¬های سرطانی کولورکتال می¬شود. بنابراین می¬توان نتیجه گرفت که سرکوب ژن SLC9A5 به همراه تیمار با اگزالی¬پلاتین می¬تواند استراتژی مفیدی جهت مهار مهاجرت و بقای سلولی، القای آپوپتوز و حساس سازی سلول¬های سرطانی به اگزالی¬پلاتین در رده¬ی سلولی SW-480 سرطان کولورکتال باشد.
Background: Colorectal cancer is the third most common cancer in the world, accounting for a high percentage of deaths in the United States. The pathogenic process in colon cancer is complex and multifactorial, and it is obvious that several genes are involved in the development of this type of cancer. Solute carrier transporters (SLCs) are the second largest family of membrane proteins in human cells that facilitate the transport of a wide array of substrates across biological membranes and play an important role in physiological processes ranging from the cellular uptake of nutrients to the absorption of drugs and other xenobiotics. Oxaliplatin is a third generation antitumor platinum drug used to treat advanced colon cancer. It works by killing cancer cells and slowing tumor growth, but the exact mechanism of cancer cell death is not fully understood. SLC9A5 is Involved in pH regulation to eliminate acids generated by active metabolism or to counter adverse environmental conditions. Major proton extruding system driven by the inward sodium ion chemical gradient. To stabilize its position, the cancer cell must alter cell metabolism in its favor, which includes changes in the metabolism of carbohydrates, fats, proteins, and nucleic acids. studies show that the first and most important change in cancer cell metabolism is a change in the metabolism of carbohydrates, which changes from aerobic metabolism to anaerobic metabolism. The product of anaerobic glucose is lactic acid, which causes the pH of the tumor to be lower than that of a normal cell, in other words, more acidic. As a result, the NHE5 transporter, encoded by the SLC9A5 gene, promotes invasion, progression, and resistance to cancer therapies by transmitting H+ ions to the cell's outer environment by creating acidic conditions in the tumor microenvironment. The aim of this study was to investigate the effect of knock down of SLC9A5 gene on the survival, growth and migration of cells in the SW-480 colon cancer cell line. In this study, colorectal cancer cells (SW-480) were cultured and pRNA-slc9a5 transfection was performed. To evaluate the effect of pRNA-slc9a5 transfection on the survival of colorectal cancer cells, MTT test was used. The migration of transfected cancer cells was also evaluated using the Scratch method. Moreover, effects of pRNA - slc9a5 transfection on apoptosis induction and the subsequent effects of pRNA - slc9a5 transfection on the cell cycle of colorectal cancer cells was assessed by flow cytometry assay. Finally, the relative expression of different genes involved in cancer development and progression (SLC9A5، BAX، BCL2، CASPASES3، CASPASES8، CASPASES9) was evaluated using qRT-PCR. Data obtained by qRT-PCR in control and treatment groups were compared and differences in the expression of the studied genes were identified. The results of the MTT assay showed that suppression of the SLC9A5 gene in combination with oxaliplatin treatment reduced the survival of cancer cells. According to the results of this study, suppression of the SLC9A5 gene in combination with oxaliplatin treatment inhibited the migration and metastasis of colorectal cancer cells. Flow cytometric analysis showed that the rate of apoptosis of cancer cells significantly increased after transfection with oxaliplatin treatment. Also, the results obtained from cell cycle examination by flow cytometry showed that the number of cells that were stopped in G0 stage in the group of transfected cancer cells with oxaliplatin treatment increased significantly. Based on the results of the expression of genes involved in cancer (SLC9A5, BAX, BCL2, CASPASES3, CASPASES8, CASPASES9), suppression of the SLC9A5 gene along with oxaliplatin treatment through various molecular mechanisms such as induction of apoptosis induces inhibition of cancer cell proliferation. Therefore, it can be concluded that suppression of SLC9A5 gene in combination with oxaliplatin treatment can be a useful strategy to inhibit migration and cell survival, induce apoptosis and increase the susceptibility of cancer cells to oxaliplatin in the SW-480 cell line.
Investigation of SLC9A5 gene knock down effect on development and migration ability of SW-480 cell line in colorectal cancer
برقیان زرنقی،
بهناز
تهیه کننده
فرساد اختر،
شانه بندی،
نادر
داریوش
استاد راهنما
استاد راهنما
تبریز
