پ۲۸۰۷۸
per
شناسایی اپی توپ های اتصالی به کلاس MHC II انسانی از سویه امیکرون ویروس SARS-Cov-2 و ساخت ORF کلروپلاستی آن
بشیر افراسیابی
کشاورزی
۱۴۰۱
۱۲۱ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
بیوتکنولوژی کشاورزی
۱۴۰۱/۱۱/۱۸
شیوع بیماری کرونا از ژانویه 2019 همه دنیا را درگیر نمود، سازمان جهانی بهداشت بر آن شد که مقررات وضعیت اضطراری و اعلام پاندمی بکند و کشورهای صاحب تجربه در تولید واکسن علیه این بیماری دست بکار شدند. با گسترش این بیماری سویههای متعددی از طریق موتاسیون ایجاد شد که آخرین ویروس¬های جهش یافته به نام امیکرون نامگذاری و معرفی شدند. با گذشت زمان، بر شانس بروز جهش‌های ویروسی افزوده شده و طراحی و تولید واکسن¬های منطقه¬ای مطرح شدند. با توجه به توسعه روزافزون و وسعت داده¬های نوکلئوتیدی و پروتئینی موجود و گسترش نرم افزارهای طراحی و مدلسازی واکسن¬ها، با شناسایی اپی¬توپ¬های جدید لازم هست واکسن‌های مورد استفاده به روز شوند. بر پایه همین اطلاعات در این پژوهش اپی¬توپ‌های سویه امیکرون كه قابل شناسايي توسط كلاس MHC Class II روي لنفوسيت¬هاي T هستند پس از شناسایی و بررسی دقیق از طریق نرم افزار ایمنوانفورماتیک IEDB برای تولید در کلروپلاست گیاه توتون انتخاب گردیدند. قطعه حاصل و مکان¬های برش آنزیمی مورد نیاز برای همسانه¬سازی در وکتور بیانی کلروپلاست توتون بر پایه رمزهای ترجیحی کلروپلاست توتون و باکتریE.coli ترجمه معکوس گردید. توالی نوکلئوتیدی استنتاجی برای تولید قطعه رمزگردان از طریق واکنش زنجیره¬ای پلیمراز تک مرحله¬ای در قالب دو آغازگر بلند از طریق طراحی آغازگرهای بلند مورد استفاده قرار گرفت. برای تولید قطعه مورد نظر که حاوی اپی¬توپ‌های شناسایی و تایید شده بودند از آغازگرهای بلند با PCR تک مرحله¬ای استفاده شد. قطعه سنتز شده با PCR تك مرحله¬ای از طریق واکنش اتصال به ناقل همسانه¬سازی خطی pTG19 حاوی ژن گزینشگر مقاوم به آنتی بیوتیک آمپی¬ سیلین متصل گردید. برای همسانه سازی وکتور حاوی اپی¬توپ از تراریختی باکتری¬های مستعدE.coli سویه DH5α استفاده شد. تراریختی باكتریها به روش شوك حرارتي انجام و برای استخراج پلاسمید نوترکیب از روش لیز قلیایی استفاده شد. با توجه به کوتاه بودن قطعه ORFدر پلاسمید نوترکیب و احتمال زیاد عدم خوانش در توالی یابی، حضور قطعه تنها با برش آنزیمی از مکان منحصر بفرد آنزیم XhoI که در انتهای قطعه سنتز شده تعبیه شده است انجام گرفت. وکتور مورد استفاده در این همسانه سازی فاقد مکان برشی XhoI می‌باشد. قطعه اپی¬توپی حاصل از این تحقیق پس از اتصال به اپی¬توپ¬های لنفوسیت¬های B و MHC Class I از طریق توالی¬یابی بطور کامل تایید خواهد شد.
AbstractSince January 2019, the outbreak of the Corona virus has affected the whole world, the World Health Organization decided to declare a state of emergency and pandemic, and countries with experience in producing vaccines against this disease began to work. With the spread of this disease, several strains were created through mutation, and the last mutated viruses were named and introduced as Omicron. Over time, the chance of viral mutations increased and the issue of designing and producing regional vaccines was raised. Considering the availability and ever-increasing of the huge nucleotide and protein data and the expansion of vaccine design and modeling software, it is necessary to update the used vaccines by identifying new epitopes. Based on this information, in this research, the epitopes of Omicron strain, which is recognized by MHC Class II on T lymphocytes, were selected for production in the chloroplast of tobacco plant after being identified and carefully checked through IEDB immunoinformatics software. The resulting fragment and the enzymatic cleavage sites required for cloning in the tobacco chloroplast expression vector were reverse translated based on the preferred codes of tobacco chloroplast and E.coli. The deduced nucleotide sequence was used to produce the coding fragment through one-step polymerase chain reaction (PCR) in the form of two long primers through designing the two long primers with 3'end complementarity. Long primers were used in one-step PCR to produce the target fragment that contained identified epitopes. The fragment synthesized by one-step PCR was ligated in the linear vector pTG19, which contains the resistant gene to ampicillin antibiotic. To clone the vector containing the epitope, the transformation of competent bacterial E.coli strain DH5α was used. Bacterial transformation was done by heat shock method and alkaline lysis method was used to extract the recombinant plasmid. Due to the shortness of the ORF fragment in the recombinant plasmid and the high probability of failure in sequencing, the presence of the fragment was done only by enzymatic cutting from the unique site of the XhoI enzyme that is embedded at the end of the synthesized fragment.. The vector used in this cloning does not have XhoI cutting site. The epitope fragment obtained from this research will be fully confirmed after binding to the epitopes of B lymphocytes and MHC Class I through sequencing
Identification of Human MHC Class II Binding Epitopes of Omicron Mutant of SARS-Cov-2 and Construction of its Chloroplastic ORF
افراسیابی،
بشیر
تهیه کننده
باغبان كهنه روز،
قلی زاده،
بهرام
اشرف
استاد راهنما
استاد مشاور
تبریز
