پ۲۵۴۰۳
per
بررسی تاثیر سرکوب بیان ژن B7H6 و داروی 5-FU در مهار رشد سلول های سرطان معده
کتایون دولت خواه
علوم طبیعی
۱۴۰۰
۱۱۶ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
زیست شناسی گیاهی سلولی و مولکولی
۱۴۰۰/۰۶/۳۱
سرطان معده یکی از شایع ترین بدخیمی ها در جهان می باشد که براساس مطالعات صورت گرفته در بین سرطان ها رتبه پنجم را از نظر مرگ و میر به خود اختصاص داده، به گونه ای که میزان بقاء پس از تشخیص اولیه حدود پنج سال می باشد. با توجه به اینکه علائم این بیماری مبهم می باشد، تشخیص آن در زمان شروع متاستاز صورت می پذیرد، بنابراین به علت عود بیماری و گسترش ضایعات حاصل از تومور، صرفا عمل جراحی کافی نبوده و متاسفانه در بیشتر موارد شاهد مرگ مبتلایان می باشیم. عواملی مختلفی در ایجاد سرطان نقش دارند که یکی از آنها ایمیون چک پوینت ها هستند، B7H6 یک نوع ایمیون چک پوینت می باشد که افزایش بیان آن منجر به سرکوب پاسخ ایمنی، رشد تومور و متاستاز سلول های سرطانی می شود. مطالعات اخیر نشان داده اند که استفاده از RNA مداخله گر (siRNA) به عنوان یک روش درمانی، با توجه به توانایی آن در خاموش کردن ژن های هدف، یک روش درمانی امیدوار کننده برای درمان سرطان می باشد. به این منظور در این تحقیق، تاثیر سرکوب بیان ژن B7H6 با استفاده از siRNA ی اختصاصی علیه B7H6 و بررسی تاثیر آن در ترکیب با داروی 5- فلوروراسیل (5-FU) بر القای آپوپتوز، توقف چرخه سلولی و مهار مهاجرت، تشکیل و رشد کلونی در سلول های سرطان معده رده سلولی MKN-45 مورد مطالعه قرار گرفت. در ابتدا، برای انتخاب رده سلولی، سطح بیان B7H6 در رده های سلولی MKN-45 و KATO-III مورد بررسی قرار گرفت. سلول های MKN-45 با بیان بالاتر B7H6 برای ادامه تحقیقات انتخاب گردید. سپس سلول ها در محیط کشت کامل کشت داده شدند تا به تراکم 70% برسند. سپس سلول ها با داروی 5-FU تیمار شدند و تحت درمان به صورت ترکیبی با siRNA B7H6 و 5-FU قرار گرفتند. علاوه بر این میزان زنده ماندن سلول ها و القای آپوپتوز به کمک آزمون های رنگ آمیزیMTT، فلوسایتومتری بررسی شد. در ادامه میزان مهاجرت سلول ها در گروه های مختلف توسط تست Wound Healing Assayو مهار تشکیل کلونی از طریق تست Colony formation ارزیابی گردید. اثر ترکیبی درمانی siRNA به همراه داروی 5-FU در چرخه سلولی با استفاده از فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفت. در مرحله بعدی سطح بیان ژن های MMP3، Caspase-3، BAX و Bcl-2 در گروه های مختلف با استفاده از RealTime-PCR اندازه گیری شد. آنالیزهای آماری نیز با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 6 انجام گرفت. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که در سلول های سرطانی معده به دنبال استفاده ترکیبی از siRNA اختصاصی B7H6 به همراه داروی 5-FU منجر به کاهش بیان ژن B7H6 میگردد. علاوه بر این استفاده ترکیبی از siRNA اختصاصی B7H6 در ترکیب با داروی 5-FU منجر به مهار مهاجرت سلولی، کاهش تشکیل کلونی و نیز موجب توقف چرخه سلولی در فاز sub G1 می شود. همچنین دیده شد، استفاده از siRNA اختصاصی B7H6 در ترکیب با داروی 5-FU باعث افزایش بیان ژن های BAX، caspase-3 و کاهش بیان ژن های Bcl-2 و MMP3 که در مسیرهای آپوپتوزیس و مهاجرت سلول ها نقش دارند، می گردد. در مجموع، نتایج این مطالعه نشان می دهد که سرکوب ژن B7H6 توسط siRNA اختصاصی B7H6 باعث کاهش مهاجرت شده و درمان ترکیبی منجر به مهار رشد سلول ها و تکثیر سلولی می گردد. بنابراین سرکوب B7H6 در ترکیب با داروی 5-FU می تواند یک رویكرد درمانی جدید در درمان سرطان معده باشد.
Gastric cancer is one of the most common malignancies in the world، considered by studies to rank 5th among cancers in terms of mortality، so the survival rate after initial diagnosis. The survival rate after initial diagnosis is about five years. Because the symptoms of this disease are vague، its diagnosis is made at the onset of metastases، therefore، due to disease recurrence and the spread of tumor lesions، surgery alone is not sufficient and unfortunately in most cases we see the death of sick people. One of the genes implicated in gastric cancer is B7H6، which activates and increases its expression، suppressing immune responses، tumor growth، and cancer cell metastasis. Recent studies have shown that the use of interfering RNAs (siRNAs) as a treatment is a promising treatment for cancer، due to its ability to turn off target genes. Therefore، in this study، the inhibitory effect of B7H6 gene expression using specific siRNA against B7H6 and its effect in combination with 5fluorouracil (5FU) on the induction of apoptosis، cycle arrest cell line and inhibition of colonogenesis and growth of the MKN45 cell line was studied in the gastric cancer cells. Initially، the expression levels of B7H6 in the MKN45 and KATOII cell lines were examined for cell line selection. MKN45 cells with higher B7H6 expression were selected for further study. Then the cells were grown in complete culture at a density of 70%. The cells were then treated with 5FU and treated with a combination of siRNA B7H6 and 5FU. In addition، cell viability and induction of apoptosis were evaluated by MTT staining، flow cytometry. Then، the rate of cell migration in the different groups was evaluated by the wound healing assay and the inhibition of colony formation via the colony formation test. The combined therapeutic effect of siRNA with 5FU in the cell cycle was investigated by flow cytometry. In the next step، the expression levels of the B7H6، Caspase3، and BAX and BCL2 genes in different groups were measured using qRTPCR. Statistical analyzes were performed using GraphPad Prism 6 software. The results of this study showed that in gastric cancer cells، after combining B7H6-specific siRNA with 5FU drug، the expression of B7H6 gene was decreased. In addition، the combined use of B7H6-specific siRNA in combination with 5FU inhibited cell migration، reduced colony formation، and cell cycle arrest at the G1 phase. It was further observed that the use of B7H6-specific siRNA in combination with 5FU increased the expression of BAX، caspase3 genes and decreased the expression of BCL2 genes involved in apoptosis and the migration pathways of B7H6 cells. Overall، the results of this study indicate that knockdown of the B7H6 gene by B7H6-specific siRNA reduces migration. Combination therapy also inhibits cell growth and cell proliferation. Therefore، removal of B7H6 in combination with 5FU could represent a novel therapeutic approach in gastric cancer
Effect of B7-H6 Gene Expression Suppression and 5-FU drug on Inhibition of Gastric Cancer Cell Growth
دولت خواه،
کتایون
تهيه کننده
محجل شجا،
برادران،
عاقبتی،
هانیه
بهزاد
لیلی
استاد راهنما
استاد راهنما
استاد مشاور
تبریز
