پ۲۷۸۲۵
per
جداسازی و بیان ژن‌های CCD2 و GTs زعفران (Crocus sativus L.) در E. coli جهت بررسی امکان تولید کروسین از بتا-کاروتن
محمد جواد حبیب زاده
کشاورزی
۱۳۹۹
۱۴۸ص.
سی دی
دکتری
بیوتکنولوژی گیاهی
۱۳۹۹/۱۱/۲۰
ایران بزرگترین تولیدکننده زعفران در جهان می¬باشد بر همین اساس زعفران در کشور به عنوان یک محصول راهبردی محسوب می‌گردد. از آنجا که متابولیت‌های آپوکاروتنوئیدی عامل ارزش اقتصادی در گیاه زعفران هستند، بنابراین جداسازی و مطالعه ژن‌های درگیر در متابولیسم کاروتنوئیدها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. در این تحقیق، باتوجه به اهمیت ژن‌های CsCCD2 و CsGTS در بیوسنتز کروسین، با هدف ایجاد سویه مهندسی شده E. coli با قابلیت بیان همزمان دوژن CsCCD2 و CsGTS، اقدام به جداسازی و بیان آنها تحت راه‌انداز قوی T7 λDE3 lysogens موجود در پلاسمید pET28a شد. پلاسمید حاصل که pETCD2GT نامگذاری شد برای انتقال به E.coli سویه Rosetta (DE3) مورد استفاده قرار گرفت. تأیید نهایی بیان این دو ژن با استفاده از سیستم‌های پروتئینیSDS-PAGE و وسترن انجام شد. ژن‌های همسانه‌سازی شده، توالی‌یابی شده و در سایت NCBI ثبت شدند. به منظور شناخت بیشتر خصوصیات این ژن‌ها، با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی ابتدا توالی پروتئینی ژن‌های مورد نظر بدست آمد و سپس ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی و فیزیولوژی پروتئین‌های CsCCD2 و CsGTS توسط سرورها و ابزارهای Protparam، SOPMA، ProtScale، Pfam، ProtComp، SignalP، TMHMM و ChloroP بررسی شدند. همچنین با استفاده از سرور Swiss-Model ساختار سه‌بعدی این پروتئین‌ها مورد بررسی قرار گرفت و جهت اعتبار سنجی ساختاری مدل ترسیم شده سه‌بعدی، نمودار راماچاندران ترسیم گردید. با توجه به نتایج حاصل، برای پروتئین CsCCD2 پیشنهاد می‌شود که این پروتئین با داشتن 562 اسیدآمینه، دارای توالی حفاظت شده 476 آمینواسیدی از پروتئین‌های خانواده کاروتنوئیداکسیژنازها می‌باشد. پروتئینی غیرقطبی است که دارای ثبات در برابر دماهای بالا می‌باشد. دارای یک دمین آبگریز بوده و فاقد سیگنال با هدف‌گیری پلاستیدی است و جایگاه سیتوپلاسمی برای آن پیش‌بینی شد. پروتئین CsGTS هم با داشتن 462 اسید آمینه دارای توالی حفاظت شده پروتئین‌های خانواده گلیکوزیل‌ترانسفراز است و پروتئینی قطبی، دارای ثبات در دماهای بالا و فاقد دمین آبگریز شناسایی شد. پروتئین CsGTS فاقد سیگنال پپتیدی یا سیگنال‌های اتصال دهنده است و جایگاهی سیتوپلاسمی دارد. این تحقیق امکان جداسازی ژن‌های CsCCD2 و CsGTS زعفران را فراهم و شرایط انتقال آنها را به داخل ناقل بیانی pET28 بهینه نمود. علاوه بر این، نتایج تجزیه و تحلیل ساختار پروتئین‌های CsCCD2 و CsGTS زمینه را برای مطالعات عملکردی آینده فراهم می‌کند و می‌تواند اطلاعات با ارزشی در رابطه با رفتار و واکنش این آنزیم‌ها در مسیر سنتز آپوکاروتنوئیدهای زعفران فراهم کند و همچنین این نتایج می توانند در برنامه های آتی اصلاح ژنتیکی زعفران ایران مفید واقع گردد.
Iran is the largest producer of saffron in the world; Accordingly, saffron is considered a strategic product in the country. Since apocarotenoid metabolites are a factor of economical value in saffron plant, so the isolation and study of genes involved in carotenoids metabolism is of particular importance. In this project, due to the importance of CsCCD2 and CsGTS family genes in crocin biosynthesis, with the aim of creating an engineered E. coli strain capable of simultaneous expression of CsCCD2 and CsGTS, they were isolated and expressed under the strong T7 λDE3 lysogens in plasmid pET28a. The resulting plasmid, named pETCD2GT, was used to transfer E. coli to the Rosetta (DE3) strain. Final confirmation of expression of these two genes was performed using SDS-PAGE and Western protein systems. Genes have been cloned, sequenced and was recorded in the NCBI site. In order to better understand the characteristics of these genes, by using bioinformatic softwares the protein sequence of target genes were obtained firstly and then the physical , chemical and physiological properties of proteins CsCCD2 and CsGTS by the server and tools Protparam, SOPMA, ProtScale, Pfam, ProtComp, SignalP , TMHMM and ChloroP were evaluated. Also, using a Swiss-Model server, the 3D structure of these proteins was examined, and for structural validation of the 3D model, the Ramachandran plot was drawn. According to the results, it is suggested that CsCCD2 protein that it contains 562 amino acids, with a conserved sequence of 476 amino acids from proteins of the carotenoid oxygenase family. Nonpolar protein that is stable to high temperatures. Has a hydrophobic domain and no signal with plastid targeting, and its cytoplasmic location was predicted. CsGTS protein with 462 amino acids has a conserved sequence of glycosyltransferase family proteins and it is polar, stable at high temperatures and lacking hydrophobic domain was identified. CsGTS proteins lack the peptide signal or binding signals and have a cytoplasmic location. This research made it possible to isolation of CsCCD2 and CsGTS family genes of saffron and optimized their transfer conditions into the pET28 expression vector. In addition, the results of structural analysis of CsCCD2 and CsGTS proteins provide the basis for future functional studies and can provide valuable information about the behavior and reaction of these enzymes in the synthesis of saffron apocarotenoids and the results can be useful for future of Iranian saffron genetic improvement programs.
Isolation and expression of saffron (Crocus sativus L.) CCD2 and GTs genes in E. coli to study the possibility ofcrocin production from β-carotene
حبیب زاده،
محمد جواد
تهیه کننده
دورانی،
زیارت‌نیا،
ولیزاده،
ابراهیم
سید مهدی
مصطفی
استاد راهنما
استاد راهنما
استاد مشاور
تبریز
