بررسی سطح بیان ژن زیرواحدهای بتا-1 و بتا-3 گیرندههای GABAA هستهی قاعدهای-جانبی آمیگدال بهدنبال تعدیل درد ناشی از ترس ذاتی در Rat های نر بالغ
مرجان امینیان
علوم طبیعی
۱۴۰۰
۱۲۵ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
زیست شناسی جانوری گرایش فیزیولوژی
۱۴۰۰/۱۱/۱۱
مقدمه: هسته قاعدهای-جانبی آمیگدال (BLA) استطاله¬های اورکسینرژیک را از هیپوتالاموس جانبی (LA) و ورودی¬های درد را از قشر و تالاموس دریافت میکند. از سوی دیگر، هسته BLA اطلاعات ترس ذاتی را از طریق ارتباطات عصبی غنی خود با هسته¬های هیپوتالاموسی پشتی-میانی/شکمی-میانی دریافت میکند. به دنبال آن، هسته BLA اطلاعات درد و ترس ذاتی را جمع¬بندی نموده و در پایان، اطلاعات پردازش شده را به بخش جانبی-کپسولی (CeLC) هسته مرکزی آمیگدال (که Nociceptive amygdala نامیده می¬شود) ارسال می¬کند. مسیر پایین¬روی تعدیل درد از CeLC شروع می¬شود. تحریک نورونهای پس¬سیناپسی هسته BLA سبب تولید آراشیدونیل¬گلیسرول (2-AG) میشود. این اندوکانابینوئید از غشا عبورکرده و به گیرندههای خود که در پایانههای پیشسیناپسی قرارگرفتهاند، اتصال پیدا میکند. فعالشدن این گیرندهها موجب مهار فعالیت آدنیلات¬سیکلاز و کاهش تولید cAMP در سلولهای پیشسیناپسی میشوند. این گیرندهها با فعالسازی کانالهای پتاسیمی و مهار ورود کلسیم به سلولهای عصبی موجب هایپرپولاریزاسیون سلول و مهار آزادسازی فاکتورهایی همچون ماده P و گلوتامات میشوند و به صورت پس¬گرد سبب هیپرپلاریزاسیون و مهار اینترنورونهای گابائرژیک هسته BLA می¬شود. کاهش رهایش GABA باعث فعالیت شدید وابران¬های هسته BLA به CeLC و فعال شدن مسیر پایین¬روی تعدیل درد می¬گردد. بنابراین، این پژوهش برای بررسی اثر برهم¬کنش سیستم¬های اورکسینرژیک و اندوکانابینوئید بر روی میزان بیان ژن زیرواحدهای β1 و β3گیرنده GABAA هسته BLA به دنبال تعدیل درد ناشی از ترس ذاتی طراحی شدهاست. روش¬ها: در این مطالعه از نمونه¬های بافتی مربوط به 91 سر موش صحرایی نراستفاده شده است. این نمونههای بافتی در سیزده گروه 7 تایی تقسیمبندی شدند. جهت بررسی تغییرات بیان ژن زیرواحدهای β1و β3 گیرنده GABAA از روش Real-Time PCR استفاده شد. در ابتدا RNA تام سلولی از هسته قاعدهای-جانبی آمیگدال نمونهها استخراج گردید. خلوص RNA توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (NanoDrop-2000c) بررسیشد. سپس از واکنش رونویسی معکوس با پرایمر رندوم هگزامر جهت واکنش رونویسی معکوس RNA و سنتز cDNA استفاده شد. در پایان نیز سطح mRNA توسط آنالیز کمی Real-Time PCR سنجیده شد. نتایج با با فرمول 2-ΔCT آنالیز شده و بیان نسبی ژن¬ها نسبت به ژن¬ مرجع نرمالایز شد.یافته¬ها: نتایج حاصل از این مطالعه نشانداد که تزریق بیکوکولین به داخل ناحیه DMH/VMH هیپوتالاموس تاًثیری بر میزان بیان ژن زیرواحدهای β1 و β3گیرنده GABAA ندارد. تزریق اورکسین A به داخل هسته BLA سبب کاهش میزان بیان ژن زیرواحد β1 و افزایش بیان ژن زیرواحد β3گیرنده GABAA گردید. تزریق SB-334867 (آنتاگونیست گیرنده اورکسین نوع 1) باعث کاهش بیان زیرواحد β1 (P<0.05) و افزایش بیان زیرواحد β3 (P<0.01) گیرنده GABAAشد؛ درحالی¬که تزریق آنتاگونیست گیرنده کانابینوئیدی نوع 1 (AM251) به داخل این هسته میزان بیان ژن زیرواحدهای β1 و β3گیرنده GABAA را تغییر نداد. مطالعات بیشتر نشان داد که پیش¬تیمار هسته BLA با SB334867 توانست تغییرات بیان ژن زیرواحد β1، (P < 0.001) و زیرواحد β3، (P < 0.05) گیرنده GABAA توسط اورکسین A در این هسته را به-طور کامل خنثی نماید. همچنین، پیش¬تیمار هسته BLA با AM251 سبب افزایش بیان زیرواحد β1، (P < 0.05) گیرنده GABAA شد ولی بیان ژن زیرواحدβ3 این گیرنده تحت¬تاثیر پیش¬تیمار این هسته با AM251 قرار نگرفت. پیش¬تیمار هسته BLA آمیگدال با SB334867 و AM251 نتوانست اثر اورکسین A در کاهش بیان ژن زیرواحدβ1 گیرنده GABAA (P < 0.0001) و افزایش بیان ژن زیرواحد β3 گیرنده GABAAی (P < 0.01) این هسته را خنثی نماید.نتیجه¬گیری: یافته¬های مطالعه حاضر نشان داد که بی¬دردی ناشی از القای ترس ذاتی به¬وسیله تغییرات بیان ژن زیرواحدهای β1 و β3گیرنده GABAA وساطت نمی¬شود. بیان ژن زیرواحدهای β1و β3گیرنده ¬GABAA نیاز مبرمی به فعال¬سازی گیرنده¬های اورکسین نوع 1 -و نه گیرنده¬های کانابینوئیدی نوع 1- دارد. این تغییرات با افزایش بیان زیرواحد β3-که اهمیت بالاتری نسبت به زیرواحد β1 دارد- در خنثی¬سازی¬ بی¬دردی القا شده با ترس ذاتی توسط اورکسین A درگیر می¬باشند.
AbstractIntroduction: The basolateral nucleus (BLA) of amygdala receives both orexinergic projections from the lateral hypothalamus (LH) and nociceptive inputs from the cortex and thalamus. On the other hand, the BLA nucleus receives innate fear information through its massive neural connections with the dorsomedial and ventromedial hypothalamic (DMH/VMH) nuclei. Subsequently, the BLA nucleus integrates the nociceptive and innate fear information, and finally, relays the processed information to the laterocapsular division of the central nucleus (CeLC) of amygdala (so-called “nociceptive amygdala”). The descending pain modulatory pathway originates from the CeLC. The stimulation of postsynaptic neurons of BLA nucleus leads to arachidonoylglycerol (2-AG) production which acts retrogradely to hyperpolarize and inhibit the GABAergic interneurons of BLA nucleus. Reduction of GABA release results in the hyperactivity of excitatory efferent of BLA nucleus to CeLC and activation of inhibitory descending pain modulatory pathway. Therefore, this research is planned to investigate the effect of crosstalk between the orexinergic and the endocannabinoid systems on the gene expression level of β1- and β3-subunits of GABAA receptor of the BLA nucleus following innate fear-induced pain modulation.Research Method: 91 Tissue samples of the BLA nucleus of male Wistar rats were used in this study. The quantitative Real Time-PCR technique was used to evaluate the gene expression alterations of β1- and β3-subunits of GABAA receptor. Primarly, the total RNA was extracted from BLA nucleus samples. The RNA purity was checked by the NanoDrop-2000c spectrophotometer. Then, a reverse transcription system with random hexamer primer was used to RNA reverse transcription and cDNA synthesis. Finally, the mRNA levels were analyzed by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). The results were analyzed using the 2-ΔCT method and presented as relative gene expression normalized to the average of the housekeeping gene.Findings:The results of this study revealed that intra-DMH/VMH injection of bicuculline had no effect on the gene expression level of β1- and β3-subunits of GABAA receptor. Intra-BLA injection of orexin A reduced the gene expression level of β1-subunit and increased the gene expression level of β3-subunit of GABAA receptor. Intra-BLA injection of SB-334867 (the orexin receptor type 1 antagonist) decreased the expression level of β1-subunit (P < 0.05) and augmented the expression level of β3-subunit (P < 0.01) of GABAA receptor, whereas intra-BLA injection of the cannabinoid receptor type 1 antagonist (AM251) did not alter the gene expression level of the β1- and β3-subunits of GABAA receptor. Further studies showed that pre-treatment of BLA nucleus with SB334867 could completely counteract the orexin A-mediated alterations of the gene expression level of β1- (P <0.001) and β3-subunits (P <0.05) of the GABAA receptor. Similarly, pre-treatment of BLA nucleus with AM251 increased the expression level of β1-subunit of GABAA receptor (P <0.05), however, the gene expression level of β3-subunit of this receptor was not affected by intra-BLA pre-treatment with AM251. Intra-BLA pre-treatment by SB334867 and AM251 could not neutralize the orexin A-mediated reduction of β1-subunit gene expression (P <0.0001) and the orexin A-mediated increment of β3-subunit of GABAA receptor gene expression (P <0.01). Discussion and Conclusion: The findings of the present study showed that the innate fear-induced analgesia is not mediated by gene expression alterations of β1- and β3-subunits of GABAA receptor. The gene expression of β1- and β3-subunits of GABAA receptor essentially requires to the orexin receptor type 1-but not the cannabinoid receptor type 1- activation. These alterations are involved in the orexin A-mediated neutralization of innate fear-induced analgesia by augmentation the expression level of β3-subunit -which has more importance than β1-subunit of GABAA receptor.
Evaluation of the gene expression level of β1 and β3 subunits of GABAA receptors of the basolateral nucleus of amygdala following innate-fear-induced pain modulation in adult male rats.