عنوان

جداسازی میکروارگانیسم های مولد آنزیم کراتیناز مؤثر برکراتین موی انسان و بهینه سازی شرایط تولید آنزیم

پ۲۶۱۷۸

per

جداسازی میکروارگانیسم های مولد آنزیم کراتیناز مؤثر برکراتین موی انسان و بهینه سازی شرایط تولید آنزیم

محدثه صبحی لاله

علوم طبیعی

۱۴۰۰

۷۲ص.

سی دی

کارشناسی ارشد

میکروبیولوژی گرایش میکروبیولوژی صنعتی

۱۴۰۰/۰۶/۲۸

با توجه به افزایش کاربرد صنعتی آنزیم های میکروبی، تلاش های فراوانی در جهت تولید بیشتر این آنزیم ها صورت گرفته است. دراین میان کراتیناز، آنزیم پروتئاز قلیایی می باشد که توسط میکروارگانیسم هایی شامل باکتری ها، قارچ ها و اکتینومایست ها تولید می شود و به عنوان کاتالیزور زیستی، با شکستن پلی پپتیدها می تواند ساختار پیچیده ی کراتین را تجزیه کرده و به محصولات با ارزش تبدیل کند.کراتین، گروهی از پروتئین های نامحلول فیبردار می باشد که بدلیل داشتن پیوندهای دی سولفیدی محکم و میزان بالای اسید آمینه ی گوگرددار سیستئین مقاومت بالایی دارد و به شکل مو، پر، پشم و... وجود دارد.موی انسان حدود 90 درصد از کراتین تشكیل شده است که با تخریب شدن توسط آنزیم کراتیناز به دلیل داشتن پپتیدهای فعال، تاثیر کارآمدی در فرآیندهای مراقبت مو مانند ترمیم و حالت دهی مو را دارد. از طرفی کراتیناز ایجاد شده در لوازم آرایشی بهداشتی پوست، مانند کرم های روشن کننده، لایه بردار و حذف لایه شاخی و حذف میخچه و پینه و در درمان آکنه و شامپوی ضد شوره، بكار برده می شود. لذا این آنزیم از اهمیت ویژه ای برخوردار است.برای جداسازی میكروارگانیسم هایی با فعالیت بالای کراتینولیتیكی مؤثر بر روی کراتین موجود در موی انسان و بهینه سازی پارامترهای مؤثر بر رشد و تولید کراتیناز، در كل 17 سويه روي محيط انتخابي كراتين دار بدست آمد. فعاليت كراتينازي سويه ها روي محيط كشت پايه نمكي جامد حاوي كراتين توسط تشكيل هاله شفاف ناشي از تجزيه كراتين بعد از اضافه كردن لوگول در محيط ارزيابي شد. در اين مرحله سه سويه KT11، KT12 و KT15 جداسازی شدند. به منظور سنجش كمي توليد آنزيم كراتيناز از روش اسپكتروفتومتري استفاده شد. ميزان فعالیت آنزيم در اين سويه ها پس از گذشت يك هفته، به ترتيب معادل nmol/min 4/3، nmol/min 7/1و nmol/min 2/1 بدست آمد. جهت شناسایی مولکولی سویه ها طبق روش آنالیز فیلوژنی ژن 16S rRNA مشخص شد که سویه KT11 به جنس Paenibacillus و سویه KT12 به جنس Bacillus و سویه KT15 بهcereus Bacillus شباهت توالی نشان دادند. به منظور بهينه سازي شرايط رشد و توليد كراتيناز از ميان روش هاي طراحي آزمايش، از روش تاگوچي به دليل هزينه ي پايين، سرعت بالا و در عين حال دقت بالاي اين روش استفاده شد. بدين ترتيب شرايط بهينه براي توليد كراتيناز در سويه ي KT11، محيط كشت با تركيبات سولفات منيزيم 02/0%، عصاره مخمر5/0% و آب پنير 1% و كشت در دماي 37 درجه سانتيگراد و 8pH= و سرعت هوادهي rpm120، در سويه ي KT12 سولفات منيزيم 02/0%، عصاره مخمر2% و آب پنير 4%، در دماي 37 درجه سانتيگراد، 7pH= و سرعت هوادهي rpm170و در سويه ي KT15، ميزان سولفات منيزيم در توليد كراتيناز بي اثر و عصاره مخمر 5/0%، آب پنير 4% و دماي 45 درجه سانتيگراد، 8pH= و سرعت هوادهي rpm120 بدست آمد.

Abstract:Due to the increasing industrial use of microbial enzymes, much research has been done to produce more of these enzymes. Among keratinases is the alkaline protease enzyme, which is produced by microorganisms including bacteria, fungi, and actinomycetes, and as a catalyst by breaking down polypeptides may break down a complex of keratin into valuable products. It is one of the insoluble fibrous proteins which has a high resistance due to its strong disulfide bonds and high amount of sulfur amino acid cysteine and there is the form of hair, feathers, wool, etc. in the environment.Human hair is composed of about 90% keratin, which is degraded by the enzyme keratinase due to its active peptides, which has an effective effect on hair care processes such as hair restoration and styling. On the other hand, keratinase created in skin cosmetics, such as lightening creams, peeling and removing the stratum corneum, removing corns and calluses, and is used in the treatment of acne and anti-dandruff shampoo. Therefore, this enzyme is of special importance.to isolate microorganisms with high keratinolytic activity effective on keratin in human hair and to optimize the parameters affecting the growth and production of keratinase. A total of 17 strains were obtained on the selective keratin medium. The keratinase activity of the strains on the medium medium solid culture medium containing keratin was evaluated by forming a clear halo due to keratin decomposition after adding logol in the medium. At this stage, three strains KT11, KT12 and KT15 were identified. Spectrophotometric method was used to quantify the production of keratinase enzyme. Enzyme production in these strains after one week was 3.4 nmol / min, 1.7 nmol / min and 1.2 nmol / min, respectively. For molecular identification of strains according to phylogenetic analysis of 16S rRNA gene, KT11 strain of Paenibacillus, KT12 strain of Bacillus and KT15 strain of Bacillus cereus showed sequence similarity. in order to optimize the growth conditions and keratinase production among the experimental design methods, Taguchi method was used due to its low cost, high speed and at the same time high accuracy of this method. Thus, the optimal conditions for keratinase production in KT11 strain, culture medium with 0.02% magnesium sulfate, yeast extract 0.5% and1% whey and culture at 37 ° C and pH = 8 and 120 rpm, in the strain KT12 of magnesium sulfate 0.02%, yeast extract 2% and whey 4%, at 37 ° C, pH = 7 and 170 rpm and in KT15 strain, the amount of magnesium sulfate in the production of inert keratinase and yeast extract 0.5%, whey 4% and 45 ° C, pH = 8 and 120 rpm.

Isolation of keratinase-producing microorganisms effective on human hair keratin and optimization of enzyme production conditions

‏صبحی لاله،

‏محدثه

تهيه کننده

‏زرینی،

صادقی،

‏غلامرضا

‏ لیلا

استاد راهنما

استاد راهنما

‏ تبریز