۲۷۳۸پ
per
همسانه سازی نواحی جناحین در ناقلهای پلاستیدی سویا
/حیدر پردل
: بین المللی ارس
۹۷ص
چاپی
کارشناسی ارشد
بیوتکنولوژی کشاورزی
۱۳۹۲/۱۲/۲۹
تبریز
اندامک‌صهای پلاستیدی یکی از جایگزین‌صهای موثر برای تولید پروتئین‌صهای نوترکیب می‌صباشد .تراریختی کلروپلاستی در قیاس با تراریختی هسته ای دارای برتری‌صهایی می باشد، از جمله آن‌صها می‌صتوان به عدم فرار ژن، فقدان خاموشی ژن و بیان بالای پروتئین و غیره اشاره کرد .آنچه در فناوری ترانسپلاستومیک متفاوت از انتقال ژن به هسته می باشد، نیاز به استفاده از ناقل‌صهای اختصاصی است، جهت تولید این ناقل‌ها همسانه سازی قطعات نواحی معین از ژنوم کلروپلاست در حامل‌های پایه ضروری است .با استفاده از این حامل‌هاست که ژن) های (مورد نظر شانس ورود هدفمند به ژنوم پلاستیدی را پیدا می کنند .برای تحقق این هدف با استفاده از نواحی ژنوم پلاستیدی سویا و نقشه فیزیکی ژن‌صهای مستقر در آن، اقدام به تعیین دو ناحیه اختصاصی برای درج ژن) های (مورد نظر نموده و سپس با استفاده از نرم افزارهای Primer Blast و Oligo ۷ برای تکثیر آنها،آغازگرصهای اختصاصی طراحی شد .این نواحی که به نواحی جناحین معروف می صباشند، به کمک آغازگرهای اختصاصی و با استفاده از DNA ژنومی کل، که به روش CTAB جدا شده و از طریق PCR تکثیر یافتند .قطعات تکثیری با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از نظر طول مورد انتظار تایید و با استفاده از کیت همسانه سازی T/A در پلاسمید خطیpTG۱۹ - Tهمسانه سازی شدند .برای تحقق این هدف باکتری‌صهای مستعد تهیه شده و با محصول واکنش اتصال که از اتصال قطعه تخلیص شده از ژل به ناقل خطی و در حضور آنزیمDNA لیگاز فاژی حاصل گردیده، مخلوط و برای تراریختی باکتری‌صهای E.coli سویه ۵DH مورد استفاده قرار گرفتند . نتیجه تراریختی به صورت کلونی‌صهای سفید در محیط گزینشگر حاوی آمپی سیلین،gal - xو IPTG مطالعه گردید و از کلونی‌صهای سفید مثبت به واکنش کلونی PCR اقدام به کشت مایع و استخراج پلاسمید گردید .پلاسمیدهای استخراج شده پس از بررسی با برش آنزیمی ، برای تعیین توالی به شرکت ژن فناوران ارسال و سپس نتایج حاصل از تعیین توالی جهت تایید صحت کار مورد ارزیابی بیوانفورماتیکی قرار گرفتند، نتایج بررسی‌صهای بیوانفورماتیکی نشان دادند که توالی مربوط به نواحی همسانه سازی شده، با توالی ثبت شده در پایگاه اطلاعات نوکلئوتیدی NCBI همولوژی قریب به ۱۰۰ دارد و بنابراین می توان از این قطعات برای ساخت ناقل‌صهای اختصاصی ترانسپلاستومیک سویا استفاده نمود
gal and IPTG. Positive clones were used for PCR reaction and then they were cultured and plasmids were isolated consequently. After enzymatic splicing of the isolated plasmids, they were sent to the Bioneer Co., South Korea, for sequencing procedure. The obtained results were evaluated using bioinformatic databases and our findings corresponded predicted goals.the results obained from bioinformatic analyses showed 100 homolog between sequence of cloning area and NCBI registered sequence. Therefore, these fragments could be used in order for production of specific transgenic vectors of Soybean-T cloning kit. The DH5 strain of Escherichia coli was used in this research. Cloning result was evaluated according to the growth of white clones of bacteria in selective medium containing ampicillin, x-Plastids organelles are one of the suitable substitutes for recombinant protein production. Chloroplast transformation is more suitable than nuclear transformation in some aspects including absence of gene escape, absence of gene silencing and high protein expression. The difference between transplastomic technology and nuclear transgenesis is the need for a specific vector. In order to create these vectors with making the specific Regions of chloroplast genome on basic vectors is essential. Using these vectors, the gene(s) will get a chance to enter the plastidy genome. To accomplish this goal, physical map of soybean plastidy genome was used for determination of two exclusive regions to insert the gene(s). Consequently, Primer Blast and Oligo7, two specific primer design software, were used for designing. These areas were isolated by CTAB method using specific primers and total genomic DNA and then were amplified by PCR. The length of amplified fragments were confirmed using agarose gel electrophoresis and then were cloned using T/A plasmid pTG19
پردل، حیدر
باغبان کهنه روز، بهرام، استاد راهنما
ولیزاده، مصطفی، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
