پ۲۵۶۱۵
per
انتقال و بيان ژن اينترفرون گاماي انساني (HU-IFN-γ) به سويا
وحيد مهري زاده
کشاورزی
۱۴۰۰
۱۷۳ص.
سی دی
دکتری
بيوتكنولوژي کشاورزی
۱۴۰۰/۶/۳۰
گیاهان به دليل تولید پروتئین¬های نوترکیب با هزينه پايين، توليد انبوه و ايمني بالا به عنوان سیستم¬های موفق در تولید پروتئین¬های نوترکیب مطرح هستند. اینترفرون¬ها به ويژه اينترفرون گاماي انساني از جمله پروتئین¬هایی هستند که ارزش درمانی بالایی دارند و علاقه شدیدی برای تولید آنها از منابع دائمی، ایمن و ارزان مثل گياهان وجود دارد. در حال حاضر از ميان گياهان مختلف، سويا به دليل برخي ويژگي¬هاي منحصر به فرد به عنوان یکی از ميزبان¬های مناسب براي توليد پروتئین¬هاي نوترکیب مطرح مي¬باشد. این پژوهش با هدف بررسي امكان بیان اينترفرون گاماي انساني در گياه سويا انجام شد. وجود یک روش کشت بافت تکرارپذیر و قابل اعتماد، مهمترین عامل موفقیت در دست¬ورزی ژنتیکی گیاهان به حساب می¬آید. لذا در پژوهش حاضر، ابتدا برخي عوامل موثر در باززایی سويا مورد بررسي قرار گرفت. بدين منظور اثر پنج ژنوتيپ رايج سويا (ويليامز، DPX، ساري، سامان و گرگان) به همراه دو نوع ريزنمونه¬ (كوتيلدون و هيپوكوتيل) و غلظت¬هاي مختلف تنظيم كننده¬هاي رشد گياهي (BAP، KIN و IAA) مورد بررسي قرار گرفتند. در تكميل اين مرحله، اثر سنين مختلف ريزنمونه كوتيلدون (6، 8، 10 و 12 روزه)، مواد ژله كننده مختلف (آگار و ژلريت) و سطوح مختلف بازدارنده اتيلني نيترات نقره (0، 5/2، 5 و 10 ميل¬گرم در ليتر) بر باززايي ارقام منتخب مورد مطالعه قرار گرفتند. همچنين براي ريشه¬زايي شاخه¬هاي باززا شده از سطوح مختلف تنظيم¬كننده¬ رشدي IBA (0، 1/0، 5/0، 1 و 2 ميلي¬گرم درليتر) استفاده شد. در گام بعدي براي انتقال ژن از طريق آگروباكتريوم، از ناقل بيان گياهي pCAMBIA-hIFN-γحاوي ژن اينترفرون گاماي انساني (HU-IFN-γ) استفاده شد. بدين منظور ابتدا ناقل بیانی نوترکیب pCAMBIA-hIFN-γ درون باکتری Escherichia coli سویه DH5α تکثیر و سپس با روش استاندارد انجماد و ذوب به سویه¬های مختلف باکتری Agrobacterium tumefaciens منتقل ¬گرديد. در ادامه برخی عوامل موثر در تراریختي سويا مانند سويه¬های مختلف آگروباكتريوم (LBA4404، EHA101وGV3101)، غلظت-های مختلف آگروباکتریوم (2/1 و 1 ،8/0 ،6/0 ،4/0 ،2/0=OD600nm)، مدت زمان¬¬های مختلف تلقيح ريزنمونه¬ها (10، 20، 30، 40 و 50 دقیقه)، مدت زمان¬های مختلف هم¬کشتی (1، 2، 3، 4 و 5 روزه) و سطوح مختلف استوسيرينگون (0، 50، 100، 150، 200 و 250 ميكرومولار) مورد بررسی قرار گرفت. همه آزمايش¬ها در قالب فاكتوريل بر پايه طرح كاملا تصادفي با چهار تكرار اجرا شدند. نتايج تجزيه واريانس داده¬ها نشان داد بين ژنوتیپ¬ها، ریزنمونه¬ها و تیمارهاي مختلف تنظیم¬کننده¬های رشد گیاهی اختلاف معني¬داري در صفات باززايي مورد مطالعه وجود داشت. بطوريكه بيشترين درصد باززايي و تعداد شاخساره باززا شده به ازاي هر ريزنمونه به ترتيب از ريزنمونه¬هاي كوتيلدون ژنوتيپ¬هاي ويليامز و سامان در تيمار 5/1 ميلي¬گرم در ليتر BAP به همراه 1/0 ميلي¬گرم در ليتر IAA مشاهده شدند. همچنین كوتيلدون¬ شش روزه به عنوان بهترين سن ريزنمونه و آگار به عنوان مناسب¬ترين ماده ژله كننده در مقايسه با ژلريت براي باززايي سويا معرفي شدند. وجود نيترات نقره به صورت معني¬دار بر باززايي سويا اثر مثبت داشت، بطوريكه بيشترين ميزان باززايي در غلظت پنج ميلي¬گرم در ليتر نيترات نقره مشاهده شد. همچنین بيشترين تعداد و طول ريشه در غلظت يك ميلي¬گرم در ليتر IBA مشاهده شد. نتايج حاصل از تراريختي ژنوتيپ¬هاي منتخب سويا (ويليامز و سامان) نشان داد بین ژنوتیپ¬هاي منتخب و سویه¬هاي مختلف آگروباکتریوم (LBA4404، EHA101وGV3101) از نظر فراوانی تراریختی، اختلاف معنی¬داري وجود داشت، بطوريكه بيشترين فراوانی تراریختی در ژنوتیپ ويليامز با استفاده از سويه EHA101 آگروباكتريوم مشاهده شد. همچنين بيشترين فراوانی تراريختي ژنوتيپ ويليامز در غلظت 1 =OD600nm سويه EHA101، مدت زمان تلقيح 30 دقيقه و مدت زمان هم¬كشتي 3 روز حاصل شد. حضور استوسيرينگون در افزايش كارايي تراريختي سويا موثر تشخیص داده شد، بطوريكه غلظت¬هاي 150 و 200 ميكرومولار استوسيرينگون باعث افزايش كارايي تراريختي شدند. بررسي مولكولي گياهان تراريخته در سه سطح DNA، RNA و پروتئين انجام گرفت. انتقال و حضور ژن hIFN-γ در گیاهان تراریخته به وسيله تكنيك PCR و آغازگرهای اختصاصی hIFN-γ مورد تاييد قرار گرفت. همچنين تعداد نسخه¬هاي درجي به وسيله لكه¬گذاري سادرن بررسي شد. در نهایت، بيان رونوشت و تولید پروتئین نوترکیب hIFN-γ به ترتیب با روش¬های RT-PCR و لكه¬گذاري وسترن تاييد شدند.
AbstractPlants are considered as successful systems in the production of recombinant proteins due to the production of recombinant proteins with low cost, large scale production and high safety. Interferons, especially human gamma interferons, have high therapeutic value and there is a strong interest in producing them from stable, safe and inexpensive sources such as plants. At present, soybean due to some unique properties is considered as one of the suitable hosts among the various plants for the production of recombinant proteins. The aim of this study was to investigate the possibility of human gamma interferon’s expression in the soybean. Having a reproducible and reliable tissue culture method is the most important factor in the successful genetic engineering of plant. Therefore, in the present study, firstly some effective factors that effected in soybean regeneration were investigated. For this purpose, the effect of five common soybean genotypes (Williams, DPX, Sari, Saman and Gorgan) with two types of explants (cotyledon and hypocotyl) and different concentrations of plant growth regulators (BAP, KIN and IAA) were investigated. In the supplementary of this step, the effect of different ages of cotyledon explants (6, 8, 10 and 12 days), different gelling agents (agar and gelrite) and different levels of silver nitrate as a ethylene inhibitor (0, 2.5, 5 and 10 mg) were studied on the regeneration of selected soybean genotypes. Also, different levels of IBA as plant growth regulator (0, 0.1, 0.5, 1 and 2 mg / l) were used for rooting of regenerated branches. In the next step, pCAMBIA-hIFN-γ as the plant expression vector that containing the human interferon-gamma gene (HU-IFN-γ) was used to Agrobacterium-mediated transformation of soybean. For this purpose, at the first, the recombinant expression vector of pCAMBIA-hIFN-γ was amplified by DH5α strain of Escherichia coli, and then transferred to different strains of Agrobacterium tumefaciens by freeze-thaw method. In the following, some of the effective factors on the transformation of soybean such as different strains of Agrobacterium (LBA4404, EHA101 and GV3101), different concentrations of Agrobacterium (OD600nm= 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 and 1.2), different inoculation time of explants (10, 20, 30, 40 and 50 minutes), different co-culture times (1, 2, 3, 4 and 5 days) and different levels of acetosyringone (0, 50, 100, 150, 200 and 250 μM) were investigated. All experiments were performed in the factorial format based on a completely randomized design (CRD) with four replications. The results of analysis of variances showed that there was significant difference in regeneration traits between genotypes, explants and different treatments of plant growth regulators. The highest percentage of regeneration and number of regenerated shoots per explant were observed in the cotyledon explants of Williams and Saman genotypes at the treatment of 1.5 mg/l BAP with 0.1 mg/l IAA, respectively. Also, six-day cotyledon was introduced as the best explant age and agar was introduced as the most suitable gelling agent in comparison with gelrite for soybean regeneration. The presence of silver nitrate significantly had a positive effect on the soybean regeneration, and the highest rate of regeneration was observed at 5 mg/l concentration of silver nitrate. Also, the results showed that the highest number and length of roots were produced at 1 mg/l of IBA. The transformation results of selected soybean genotypes (Williams and Saman) showed that there was significant difference in the frequency of transformation between the genotypes and strains of Agrobacterium tumefaciens (LBA4404, EHA101 and GV3101), and the highest frequency of transformation was observed in Williams’s genotype with EHA101 strain of Agrobacterium. Also, the highest transformation frequency was obtained in the OD600nm = 1 of EHA101 strain, at 30 minutes of inoculation time and 3 days of co-cultivation. The presence of acetosyringone had the increasing effect on the efficiency of soybean transformation, and the highest percentage of transformation was obtained in the 150 and 200 μM of acetosyringone. Molecular analysis of transgenic plants was performed at three levels of DNA, RNA and protein. Transfer and presence of hIFN-γ gene in the transgenic plants were confirmed by PCR technique and specific primers of hIFN-γ gene. Also, the integration and copy number of the hIFN-γ gene was confirmed by southern blot analysis. Finally, the expression of hIFN-γ transcript and production of recombinant hIFN-γ protein were confirmed by RT-PCR and western blot techniques, respectively.
Transformation and expression of human gamma interferon gene (HU- IFN-γ) in soybean
مهري زاده،
وحيد
تهيه کننده
دوراني،
محمدي،
قره ياضي،
ابراهيم
سيد ابوالقاسم
بهزاد
استاد راهنما
استاد مشاور
استاد مشاور
تبریز
