عنوان

مطالعه درون شیشه ای تاثیر پیپرین بر ویژگیهای ساختاری، عملکردی و سینتیک آنزیم کاتالاز کبد گاوی

پ۲۵۸۱۲

per

مطالعه درون شیشه ای تاثیر پیپرین بر ویژگیهای ساختاری، عملکردی و سینتیک آنزیم کاتالاز کبد گاوی

لیلا سجودی

علوم طبیعی

۱۴۰۰

۶۸ص.

سی دی

کارشناسی ارشد

زیست شناسی گرايش سلولی و مولکولی

۱۴۰۰/۰۹/۲۷

چکیده واکنشهای زیستی در سلول¬های زنده منجر به تولید مداوم گونه¬های فعال اکسیژن (ROS) می¬گردد که در غلظت¬های بالا قادر هستند با ایجاد اختلال در سیستم ایمنی باعث بروز بیماری-های مختلف شوند. همچنین به دلیل واکنش¬پذیری بالا توانایی صدمه زدن به مولکول¬های زیستی را دارند. سلول¬ها با حضور آنزیم¬های آنتی¬اکسیدان و تجزیه گونه¬های فعال اکسیژن از تجمع ROS ها جلوگیری می¬نمایند. کاتالاز به¬عنوان یکی از مهم¬ترین آنزیم¬های آنتی¬اکسیدان با تجزیه پراکسید هیدروژن، سلول¬ها را از اثرات سمی این گونه فعال اکسیژن حفظ می¬نماید. با توجه به این که هر گونه اختلال در عملکرد آنزیم کاتالاز در اثر مصرف ترکیبات غذایی و دارویی منجر به تجمع ROS ها و بروز ناهنجاری می¬گردد، از این رو بررسی میان¬کنش ترکیبات مختلف مورد مصرف انسان با آنزیم کاتالاز حائز اهمیت می¬باشد. یکی از این ترکیبات پیپرین است که از آلکالوئیدهای مهم فلفل سیاه (Piper nigrum) می¬باشد و در صنایع غذایی و داروسازی کاربرد گسترده¬ای دارد. هدف از این پژوهش بررسی اثر پیپرین بر ساختار و عملکرد آنزیم کاتالاز کبد گاو به عنوان مدل آنزیم¬های آنتی¬اکسیدان می¬باشد. در این مطالعه تئوری و تجربی، تغییرات در فعالیت آنزیم کاتالاز به واسطه تغییر جذب هیدروژن پراکسید (سوبسترا) در طول موج 240 نانومتر با استفاده از مطالعات سینتیکی در غیاب و حضور غلظت¬های مختلف پیپرین (6/46-0 میکرومولار) بررسی شد. همچنین اثر پیپرین بر ساختار سه¬بعدی آنزیم کاتالاز از طریق اسپکتروسکوپی جذبی مرئی- فرابنفش، فلوئورسانس و فلورسانس همزمان با مطالعه تغییر در نشر ذاتی آنزیم در دمای 25 و 37 درجه سانتی¬گراد بررسی شد. روش تئوری مورد استفاده در این پژوهش داکینگ مولکولی بود که محل اتصال پیپرین بر روی کاتالاز را پیش-بینی کرد. مطالعات سینتیکی پژوهش حاضر نشان داد که در حضور غلظت¬های افزایشی پیپرین فعالیت آنزیم کاتالاز کاهش یافت و مهار شد. مقدار 14/0 K_i= و 8/22 〖IC〗_50= میکرومولار محاسبه گردید و مکانیسم مهار از نوع مخلوط تشخیص داده شد. مطالعات طیف سنجی مرئی- فرابنفش و طیف سنجی فلوئورسانس، تغییر در ساختار سه¬بعدی کاتالاز در حضور پیپرین را به ترتیب از طریق افزایش جذب و خاموشی نشرفلوئورسانس نشان دادند. مطالعه فلوئورسانس همزمان نیز تغییر جزئی در محیط کروموفورهای کاتالاز را در حضور پیپرین ثابت کرد. بر اساس نتایج حاصل از مطالعات فلوئورسانس مکانیسم خاموشی از نوع استاتیک پیشنهاد گردید. مطالعات ترمودینامیکی نیز حاکی از خودبه¬خودی بودن واکنش پیپرین با کاتالاز (ΔG<0) بود. همچنین غالب بودن میانکنش¬های هیدروفوبیک را در این برهمکنش نشان داد. وجود یک جایگاه اتصال پیپرین بر روی کاتالاز نیز از این مطالعات استنباط شد. مطالعات داکینگ مولکولی نیز نشان دادند که کمترین انرژی اتصال پیپرین به کاتالاز 27/5- بود و محل اتصال در نزدیکی دمین آلفا هلیکس و دور از جایگاه فعال آنزیم می¬باشد. نتایج مطالعات تئوری تائید¬کننده نتایج آزمایشگاهی بود. از نتایج این پژوهش می¬توان دریافت که علیرغم وجود خواص مفید فراوان در فلفل سیاه استفاده از این ادویه در رژیم غذایی انسان در حد بالاتر از نرمال می¬تواند تاثیر سوء بر عملکرد آنزیم کاتالاز بگذارد و تهدید¬کننده سلامتی انسان باشد.

Abstract Biological reactions in living cells lead to the continuous production of reactive oxygen species (ROS), which in high concentrations are able to cause various diseases by disrupting the immune system. They also have the ability to damage biological molecules due to their high reactivity. Cells prevent the accumulation of ROS by the presence of antioxidant enzymes and the breakdown of reactive oxygen species. Catalase, as one of the most important antioxidant enzymes, protects cells from the toxic effects of this reactive oxygen species by breaking down hydrogen peroxide. Considering that any dysfunction of the catalase enzyme due to the consumption of food and drug compounds leads to the accumulation of ROS and the occurrence of abnormalities, so it is important to investigate the interaction of different compounds consumed by humans with the catalase enzyme. One of these compounds is Piperine, which is one of the important alkaloids of black pepper (Piper nigrum) and is widely used in food and pharmaceutical industries. The aim of this study was to investigate the effect of Piperine on the structure and function of bovine liver catalase as a model of antioxidant enzymes. In this study, catalase activity was investigated based on the reduction in hydrogen peroxide absorption (as a substrate) at 240 nm in the presence and absence of different concentrations of piperine (0-6/46 μM). The effect of piperine on the three-dimensional structure of catalase was investigated using ultraviolet-visible absorption spectroscopy, and spectrofluorimetry at 25 and 37 °C. Molecular docking was used to predict the binding mode of a piperine on catalase three-dimensional structure. Kinetic studies showed that, in the presence of increasing concentrations of piperine, catalase activity was reduced and inhibited. Ki and IC50 are calculated as 14/0 and 8/22 μM, respectively and the inhibition mechanism was a mixed inhibition. Uv-Vis and fluorescence spectroscopic studies showed a crucial change in the three-dimensional structure of the catalase in the presence of piperine. Synchronous fluorescence study also showed a slight change in the microenvironment of catalase chromophores in the presence of piperine. Based on the fluorescence data, static quenching played main role following the interaction between catalase and piperine. Thermodynamic studies also showed that the reaction of piperine with catalase was spontaneous (ΔG <0). It also showed the predominance of hydrophobic interactions in this interaction. Molecular docking studies showed that the lowest binding energy of piperine to catalase was -27/5 and the binding site was near the alpha helix domain and away from the active site of the enzyme. The results of the theoretical study confirmed the experimental data. From the results of this study, it can be seen that despite the lots of advantages of black pepper, as a a food additive, high concentration of this spice in human diet can adversely affect the function of catalase and threaten human health.

The in vitro study of the effect of piperin on the structural and functional properties and kinetics of bovine liver catalase

‏سجودی،

‏ لیلا

تهيه کننده

‏محجل شجا،

دهقان،

‏هانیه

‏ غلامرضا

استاد راهنما

استاد مشاور

‏ تبریز