عنوان

تهیه‌ی آنتی بادی نوترکیب در برابر ویروس برگ بادبزنی مو و بررسی کارایی آن در آزمون های سرولوژیک و سرومولکولی

‭۱۲۲۷۰پ‬

per

تهیه‌ی آنتی بادی نوترکیب در برابر ویروس برگ بادبزنی مو و بررسی کارایی آن در آزمون های سرولوژیک و سرومولکولی

/داود کولیوند

: دانشکده کشاورزی

‮‭۱۵۰‬ص‬

چاپی

دکتری

در رشته بیماری شناسی گیاهی گرایش ویروس شناسی

‮‭۱۳۹۲/۱۱/۲۵‬

تبریز

انگور ‮‭(Vitis vinifera)‬ یکی از محصولات مهم باغی در ایران و جهان است .ایران از لحاظ سطح زیر کشت و تولید انگور جزء ده کشور اول دنیا است .در بین بیماری‌صهای متعدد انگور، بیماری برگ بادبزنی مو مهمترین بیماری ویروسی درختان مو در سراسر دنیا و ایران می‌صباشد .از این‌صصرو، شناسایی به موقع و زود هنگام این بیماری و تشخیص پایه‌صهای آلوده می‌صتواند کمک زیادی به کنترل و مدیریت بیماری مذکور نماید .به همین منظور از جدایه-های بومی این ویروس برای تهیه آنتی‌صبادی نوترکیب به منظور شناسایی نمونه‌صهای مشکوک استفاده شد .در این راستا دو ژن پروتئین پوششی و پروتئین حرکتی ویروس پس از تکثیر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، در پلاسمید بیان)‮‭pET۲۱a‬ + (همسانه سازی شدند و به منظور بیان در باکتری ‮‭E. coli‬ به دو سویه مختلف ‮‭Rosetta‬ و ‮‭BL۲۱ (DE۳)‬ این باکتری به روش شوک حرارتی منتقل شدند .پس از بهینه‌صسازی بیان ژن‌صهای مذکور در باکتری توسط کاربرد غلظت‌صهای مختلف‮‭IPTG (۱‬ ، ‮‭۲‬ و ‮‭۶‬ میلی مولار (و مدت زمان پس از القا‮‭(۳‬ ،‮‭۴‬ ، ‮‭۶‬ و ‮‭۱۶‬ ساعت(، بررسی پروتئین بیان‌صشده در بین پروتئین‌صهای استخراج شده از باکتری توسط الکتروفورز در ژل پلی-آکریل آمید انجام گرفت .نتایج الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید حاکی از بیان ژن پروتئین پوششی ‮‭(۱۵۱۲‬ جفت‌صباز (و ژن پروتئین حرکتی ‮‭(۱۰۴۴‬ جفت‌صباز (در باکتری بود بطوریکه در سویه ‮‭Rosetta‬ حاوی سازه ‮‭pET۲۱aGFLVCP‬ باند پروتئینی حدود ‮‭۶۰‬ کیلودالتون مربوط به پروتئین پوششی و در سویه ‮‭BL۲۱ (DE۳)‬ حاوی سازه ‮‭pET۲۱aGFLVMP‬ باند پروتئینی حدود ‮‭۴۱‬ کیلودالتون مربوط به پروتئین حرکتی قابل مشاهده بود که اختلاف وزن پروتئین‌صهای بیان شده در مقایسه با پروتئین‌صهای عادی ویروس، به دلیل وجود دنباله هیستیدین در انتهای کربوکسیلی و همچنین دنباله ‮‭T۷‬ در انتهای آمینی پروتئین‌صهای بیان‌صشده در باکتری می‌صباشد .سپس به منظور تایید پروتئین بیان شده آزمون لکه‌صگذاری وسترن با استفاده از آنتی بادی اختصاصی ویروس برگ بادبزنی مو و همچنین آنتی بادی ‮‭anti.His.tag (Sigma Aldrich,USA)‬ انجام شد .آنتی بادی‮‭anti.His.tag‬ ، پروتئین پوششی و پروتئین حرکتی بیان شده در باکتری را روی غشاء نیتروسلولزی پس از انتقال باندها به غشاء، ردیابی نمود که نشان دهنده‌صی وجود دنباله هیستیدین در انتهای کربوکسیلی پروتئین‌صها بود و علاوه بر آن، آنتی بادی اختصاصی ویروس برگ بادبزنی مو پروتئین پوششی بیان شده را روی غشاء نیتروسلولزی آشکار نمود .سپس پروتئین‌صهای بیان شده‌صی هدف با دو روش طبیعی و دناتوره بر اساس دنباله‌صهای هیستیدین در انتهای کربوکسیلی و دنباله ‮‭T۷‬ در انتهای آمینی خالص‌صسازی شدند .پس از تایید پروتئین‌صهای تخلیص شده در‮‭PAGE - SDS‬و آزمون لکه گذاری وسترن، از پروتئین‌صهای مذکور به عنوان ماده ایمنی‌صزا جهت ایمن سازی استفاده شد .بدین منظور، از مقدار مناسب آنتی‌صژن ‮‭(۱۰۰‬ میکروگرم (تهیه شده طی سه مرحله تزریق به خرگوش با ادجوانت کامل فروند) تزریق اولیه (و ناقص فروند) تزریق-های ثانویه یا بوسترها (انجام پذیرفت .پس از بررسی ایمنی‌صزایی و ایمن شدن حیوان، خونگیری انجام شد و سرم خون خرگوش‌صهای ایمن شده برای تعیین عیار سرم در آزمون الایزای غیر مستقیم استفاده شدند .عیار آنتی سرم تهیه شده علیه پروتئین پوششی نوترکیب حدود ‮‭۱:۳۰۰۰۰‬ و نهایت عیار تعیین شده برای پروتئین حرکتی نوترکیب حدود ‮‭۱:۱۶۰۰۰‬ بود .پس از تعیین عیار سرم‌صهای تهیه شده خالص سازی ایمنوگلوبولین گاما از سرم بر اساس پروتئین ‮‭A‬ انجام شد .پس از خالص سازی ‮‭IgG‬ تهیه شده علیه پروتئین حرکتی و پروتیئن پوششی و تایید آن، نشان دار کردن ایمنوگلوبولین‌صها با استفاده از آنزیم آلکالین فسفاتاز برای تهیه آنتی بادی نشان‌صدار اختصاصی انجام شد .کارایی آنتی‌صبادی و آنتی بادی نشان‌صدار شده با آزمون‌صهای مختلف از جمله، الایزای غیر مستقیم، لکه گذاری روی کاغذ نیتروسلولزی ‮‭(DIBA)‬ و آزمون لکه گذاری وسترن انجام گرفت، نتایج نشان داد کاربرد رقت ‮‭۱:۱۰۰۰‬ آنتی بادی علیه پروتئین پوششی و رقت ‮‭۱:۵۰۰‬ آنتی بادی تهیه شده علیه پروتئین حرکتی به منظور ردیابی آنتی‌صژن مناسب است .همچنین نهایتا از آزمون الایزای مستقیم برای کارایی کاربرد همزمان آنتی‌صبادی معمولی و آنتی بادی نشان دار نوترکیب استفاده شد .که نتایج نشان داد آنتی بادی‌صهای تولید شده علیه پروتئین پوششی و پروتئین حرکتی قادر به ردیابی پروتئین تخلیص شده، پروتئین بیان شده در باکتری و همچنین ویروس در گیاه آلوده به برگ بادبزنی می‌صباشند .نتایج نشان داد استفاده از تکنیک بیان پروتئین در باکتری برای تولید آنتی بادی نوترکیب جهت ردیابی و شناسایی جدایه های مختلف ویروس برگ بادبزنی مو در کشور می‌صتواند مفید و کاربردی باشد و با استفاده از این آنتی بادی‌صها می‌صتوان بر مشکلات موجود در کاربرد و تهیه آنتی‌صبادی‌صها به روش سنتی فائق آمد و از چنین آنتی بادی‌صهایی برای ردیابی جدایه های بومی با عملکرد بهتر استفاده نمود

ELISA was done to evaluate the IgGs and the conjugated IgG, simultaneously. These results showed that these antibodies were useful to detect the GFLV isolates in ELISA and Western Blot-CP antiserum was around 1:30000 and that of MP protein around 1:16000. IgG purification was done by IgG purification kit that was based on protein A. Then, the IgGs was used to prepare the conjugated antibody by alkalin phosphatase. IgG and conjugated IgG were applied in the indirect ELISA to evaluate the efficiency of the prepared antibodies separately. In addition, western blot was done by IgGs to detect the expressed protein and GFLV infected grapevine leaves. The result showed the IgGs were useful to detect the antigenic materials in 1:1000 and 1:500 dilutions for CP and MP antibodies, respectively. Finally, DAS-terminal of expressed proteins. Then, the purified proteins were injected to the rabbits to raise the antiserum against CP and MP proteins. Titration of the obtained antiserum was determined by the indirect ELISA that the result showing the final titer of the anti- and C- terminal) and a band around the 41 kDa was related to the MP gene. The expressed proteins were verified in western blotting by the use of anti.His.Tag antibody. Further, the expressed coat protein was verified by GFLV specific antibody of GFLV in the western blotting. Then, the protein purification was done following native and denatured protein purification methods based on tags in the N- and C-PAGE, a band with around the 60 kDa in size was revealed on the gel which related to the coat protein (with N-Grapevine (Vitis Vinifera L.) is an important horticultural crop in Iran and the world. Iran is one of top ten most countries in grapevine cultivation. It is produced mainly in three distinct region of Iran, namely northwest, northeast and southwest. Grapevine fanleaf virus (GFLV) is the most widespread viral disease of the grapevines around the world including Iran. The detection of the virus and diagnosis of the diseases in the orchards and nurseries are very useful for disease management. In this study, a local isolate as used to prepare the recombinant antibody for the detection of new GFLV in plant material. To this aim, the coat protein (CP) and movement protein (MP) genes were amplified by specific primers and cloned into bacterial expression vectors to express the recombinant related proteins. The constructs (pET2aGFLVCP and pET21aGFLVMP) were transferred into the expression strain of E. coli include Rosetta and BL21 (DE3) by heat chock method. In order to optimize the expression, various concentrations of IPTG (1, 2 and 6mM) were applied to induce the T7.promotor for expressing the CP and MP genes. Also, the induced bacterial growth samples were collected at different time (3, 4, 5 and 16 hours) after induction with IPTG. After running the proteins extracted from the bacteria on the SDS

کولیوند، داود

سخندان بشیر، نعمت، استاد راهنما

بهجت نیا، سید علی اکبر، استاد مشاور

جعفری جوزانی، رضی الله، استاد مشاور

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی