پ۲۵۷۱۷
per
ساخت ناقل CRISPR/Cas9 جهت هدف‌گیری ژن استارچ فسفریلاز L سیب‌زمینی
فهیمه هادی
کشاورزی
۱۴۰۰
۱۱۷ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
بیوتکنولوژی کشاورزی
۱۴۰۰/۰۶/۲۸
چکیده: سیب زمینی یکی از محصولات مهم اقتصادی در دنیا است و از نظر میزان تولید در رده چهارم قرار دارد. غده های سیب زمینی در دماهای پایین درانبار نگهداری می شوند. در اثر دمای پایین، نشاسته موجود در سیب زمینی تجزیه شده و به قندهای ساده گلوکز، فروکتوز و ساکارز تبدیل می شود. وجود این قندها در سیب زمینی کاهش کیفیت محصول را به دنبال دارد. ژن استارچ فسفریلازL، یکی از ژن های مهم درگیر در مسیر تجزیه نشاسته است، جهت جلوگیری از انباشته شدن این قندها، از کار انداختن ژن استارچ فسفریلازL راهکار مهمی است. در تحقیق حاضر، ناقل اختصاصی CRISPR/Cas9 جهت هدف گیری ژن استارچ فسفریلاز L سیب زمینی ساخته شد. این سیستم به عنوان یک سیستم ایمنی اکتسابی در اکثر باکتری ها و آرکئی ها وجود دارد و از دو جز پروتئین اندونوکلئاز Cas9 برگرفته از باکتری Stereptococus pyogenes و توالی RNA راهنما (gRNA) تشکیل شده است. بدین ترتیب که ابتدا توالی ژن استارچ فسفریلازL از داده پایگاه NCBI استخراج و با استفاده از نرم افزارهای Crispr direct و Tefor¬¬ توالی gRNA اختصاصی تعیین و نواحی غیر هدف بررسی گردید. پلاسمید (pBlueScript SK+) پایه ای که شامل راه انداز U6 آرابیدوپسیس و RNA داربستی متصل به Cas9 است جهت درج توالی gRNA استفاده شد. با استفاده از روش SOEing PCR توالی gRNA، مابین توالی پروموتر U6 آرابیدوپسیس و توالی اسکافولد قرار گرفت؛ بدین منظور دو جفت آغازگر مستقیم و معکوس طراحی شده و سه مرحله PCR انجام گرفت. کاست مربوطه در ناقل pTG19 و در باکتری E. coli سویه DH5α همسانه سازی شده و جهت تایید آن به توالی یابی ارسال گردید. پس از اطمینان از درج صحیح قطعه، کاست sgRNA توالی یابی شده در وکتور بیانی pFGC-pcoCas9 با استفاده از واکنش برش آنزیمی XbaI/EcoRI همسانه سازی شد. کلنی های نوترکیب در محیط انتخابی LB حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین غربال شده و با استفاده از واکنش کلنی PCR تایید شدند.
Abstract: Potato is one of the most important economic products in the world and is in the fourth place in terms of production. Potato tubers are stored at low temperatures. Starch is one of the most important compounds in potatoes and has a wide range of food and industrial applications. Due to the low temperature, the starch in potatoes is decomposed into simple sugars such as glucose, fructose and sucrose. The presence of these sugars in potatoes reduces the quality of the product. Starch phosphorylase L gene is one of the important genes involved in starch degradation. In order to prevent the accumulation of these sugars, inactivation of Starch phosphorylase L gene is an important solution. In the present study, the Crispr/Cas9 technique was used to knock out and disable this gene. This system exists as an acquired immune system in most bacteria and archaea and consists of two components of the Cas9 endonuclease protein derived from Stereptococus pyogenes and the guid RNA sequence (gRNA). Thus, first, the sequence of Starch phosphorylase L gene was extracted from the NCBI database, and using Crispr direct and Tefor software, specific gRNA sequences were determined and non-target regions were examined. The base plasmid (pBlueScript SK+) containing the Arabidopsis U6 primer and the scaffold RNA attached to Cas9 was used to insert the gRNA sequence. Using SOEing PCR, the gRNA sequence was located between the Arabidopsis U6 promoter sequence and the Scaffold sequence; For this purpose, two pairs of direct and reverse primers were designed and three steps of PCR were performed. The relevant cassette was cloned in pTG19 vector and in E. coli strain DH5α strain and sent to sequencing for confirmation. After ensuring the correct insertion of the fragment, the sgRNA cassette sequenced in the pFGC-pcoCas9 expression binary vector was cloned using the XbaI / EcoRI enzymatic cleavage reaction. Recombinant colonies were screened in LB medium containing kanamycin antibiotic and confirmed by PCR colony reaction.
Construction of CRISPR/Cas9 based-expression vector for targeting starch phosphorylase L gene of Solanum Tuberosum L
هادی،
فهیمه
تهيه کننده
باغبان کهنه روز،
نوروزی،
بهرام
مجید
استاد راهنما
استاد مشاور
تبریز
