۱۱۱۶۰پ
per
جداسازی و همسانه سازی راه‌اندازهای اختصاصی E۸ و ۲A۱۱ گوجه فرنگی و بررسی بیان موقت ژن gus تحت این راه‌اندازها
/داود یاوری
: دانشکده کشاورزی
۷۵ص
چاپی
کارشناسی ارشد
در رشته بیوتکنولوژی کشاورزی
۱۳۹۲/۰۶/۱۸
تبریز
جداسازی و بررسی خصوصیات راه‌صاندازهای اختصاصی برای دستورزی و بیان هدفمند پروتئین‌صهای نوترکیب در گیاهان از اهمیت زیادی برخوردار است .برای جداسازی و بررسی فعالیت راه‌اندازهای اختصاصی E۸ و ۲A۱۱ میوه گوجه‌صفرنگی، بذور گوجه‌صفرنگی بومی میوه ریز سردشت در گلخانه کشت و DNA ژنومی از برگ‌صهای جوان با روش CTAB استخراج گردید .برای تکثیر راه‌صاندازها، آغازگرهای اختصاصی بر اساس نواحی حفاظت شده توالی‌صهای موجود در پایگاه داده NCBI طراحی شد .قطعات تکثیری راه‌صاندازها بعد از اتصال به ناقلpTZ۵۷R/T ، برای همسانه‌صسازی به سلول‌صهای مستعد باکتری E. coli نژاد DH۵ منتقل گردید .از کلنی‌های سفید، پس از تائید حضور قطعات درجی با آزمون کلنیPCR ، پلاسمید استخراج و برای توالی‌صیابی استفاده شد .بعد از توالی‌صیابی، هم‌صردیفی توالی‌صهای حاصل و بررسی بیوانفورماتیکی نشان دهنده صحت توالی راه‌صاندازهای E۸ و ۲A۱۱ جداسازی شده بود .برای بررسی فعالیت راه‌صاندازها در بافت میوه گوجه‌صفرنگی، ابتدا آن‌صها به حامل بیان گیاهی pBI۱۲۱ متصل و پس از همسانه‌صسازی در باکتری E. coli نژادDH۵ ، از کلنی‌صهای تراریخته تائید شده با کلنی PCR ، پلاسمید استخراج و با برش آنزیمی حضور قطعات راه‌صانداز در آن-ها تائید شد .پلاسمیدها به سلول‌صهای آگروباکتریوم نژاد GV۳۱۰۱ منتقل شدند .ژن گزارشگر gus تحت راه‌صاندازهای E۸ و ۲A۱۱ جهت بررسی بیان موقت، به کمک آگروباکتریوم‌صهای تراریخته به بافت میوه منتقل شدند .ظهور رنگ آبی نشان‌ص دهنده بیان موفق ژن گزارشگر gus تحت کنترل راه‌اندازهای E۸ و۲A۱۱ ، در سلول‌صهای دریافت کننده سازه ژنی بود و در غلظت =۶/۰OD۶۰۰ آگروباکتریوم، بیان واضح‌صتر و تغییر رنگ شدید مشاهده شد
Isolation and study of specific promoter properties is very important for efficient expression of recombinant proteins in plants. To isolate and study of E8 and 2A11 tomato fruit specific promoters activity, seeds of local small fruit Sardasht genotype were sown in greenhouse and genomic DNA was extracted from young leaves using CTAB method. To amplify the promoters, specific primers were designed based on conserved regions of the sequences available at NCBI database. The amplified fragments ligated into PTZ57R/T vector and for cloning were transferred into competence cells of DH5 strain of E. coli. Plasmid was extracted from white clones after confirming the presence of the inserted segments in plasmid based on PCR colony test. The extracted plasmids were used for sequencing the fragments. After Sequencing, alignment of the resulting sequences and bioinformatics analysis revealed successful isolation of E8 and 2A11 promoters segments. To analyze the activity promoters in tomato tissues, the promoter fragments were ligated into pBI121 plant expression vector and cloned DH5 strain of E. coli. Plasmid was extracted from transgenic colonies and presence of promoter segments in the plasmids was confirmed based on by enzyme digestion. The transformed plasmids were transferred to GV3101 strain of Agrobacterium. To analyze the transient expression, gus gene under E8 and 2A11 promoters with aim of transgenic Agrobacterium was Agroinfiltration into fruit tissue. Presence of blue color indicated successful expression of gus reporter gene under E8 and 2A11 promoters at the cells receipt the gene construct. At the OD600=0.6 concentration of Agrobacterium, clear gus expression and high color change was observed
یاوری، داود
محمدی، سید ابوالقاسم، استاد راهنما
دورانی علیایی، ابراهیم، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
