پ۲۵۹۵۱
per
اثر ترکیبات آلبندازول و تری‌کلابندازول بر روی پارامترهای بیوشیمیایی آنزیم لاکتوپراکسیداز تحت شرایط in vitro
حامد اصلی قره باغ
دامپزشکی
۱۴۰۰
۱۲۸ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
دامپزشکی علوم پایه بیوشیمی بالینی
۱۴۰۰/۱۱/۱۰
آنزیم لاکتوپراکسیداز (EC 1.11.1.7) یک گلیکوپروتئین از خانواده پراکسیداز ها است که با خاصیت ضد میکروبی و آنتی اکسیدانی در ترشحات برون ریز مانند بزاق، اشک و شیر یافت می شود. این آنزیم در غدد برون ریز اشکی، بزاقی، بینی، برونش ها و ترشحات روده ای فعال شده و از طریق اکسیداسیون تیوسیانات به واسطه پراکسید هیدروژن باعث تولید هایپوتیوسیانات گردیده و از این طریق خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد ویروسی از خود نشان می دهد. لاکتوپراکسیداز نقش مهمی در حفاظت از غدد پستانی و همچنین دستگاه گوارشی (روده ای) در نوزادان دارد. در این تحقیق اثر دو ترکیب آلبندازول و تری کلابندازول (ترکیبات ضد انگلی مشتق از خانواده بنزایمیدازول ها) بر روی برخی پارامترهای بیوشیمیایی آنزیم لاکتوپراکسیداز خالص شده با منشاء گاوی پس از تعیین شرایط بهینه آنزیمی بررسی گردید. جهت تائید خلوص آنزیم مربوطه، از تکنیک ژل الکتروفورز SDS-PAGE به همراه استاندارد مارکر پروتئینی با متد لاملی استفاده شد. همچنین برای سنجش پارامترهای سینتیکی آنزیم لاکتوپراکسیداز در حضور و غیاب دو ترکیب آلبندازول و تری کلابندازول از روش های اسپکتروفتومتری استفاده گردید. نتایج حاصل از الکتروفورز SDS-PAGE آنزیم در حضور استاندارد مارکر پروتئینی وجود یک باند در ژل با وزن مولکولی در حدود 78 کیلودالتون را تائیدکرد. بررسی پروفایل pH فعالیت آنزیمی نشان داد که بهترین pH برای عملکرد لاکتوپراکسیداز با منشاء گاوی برابر با pH=6 می باشد. همچنین نتایج حاصل از رسم نمودار لینویور-برک آنزیم لاکتوپراکسیداز در حضور دو سوبسترای ABTS و پراکسید هیدروژن نشان داد که میزان ثابت میکائیلیس (Km) آنزیم برای دو سوبسترای ABTS و پراکسید هیدروژن به ترتیب برابر با 0.61 mM و 0.029 mM و میزان V max آن به ترتیب برابر با 5.84 U/ml و U/ml 2.93 می‌باشد. همچنین بررسی اثر دو ترکیب تری کلابندازول و آلبندازول بر روی فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز نشان داد که هر دو ترکیب به صورت وابسته به دوز آنزیم را مهار نموده و این اثر مهاری از مکانیسم وابسته به زمان تبعیت نمی کند. همچنین از طریق رسم نمودار میزان درصد فعالیت آنزیم در حضور غلظت های مختلف هر یک از ترکیبات تری کلابندازول و آلبندازول میزان IC50 (غلظتی از لیگاند که سبب کاهش 50 درصدی فعالیت آنزیم می گردد) محاسبه گردید. نتایج نشان داد که IC50 ترکیب تری کلابندازول نسبت به ترکیب آلبندازول حدود 24/3 برابر کمتر بوده و در نتیجه تری کلابندازول اثر مهاری شدیدتری نسبت به آلبندازول بر روی آنزیم لاکتوپراکسیداز نشان می دهد. همچنین محاسبه Ki (ثابت مهاری کمپلکس آنزیم-مهارکننده) هر یک از لیگاند های تری کلابندازول و آلبندازول از طریق رسم نمودار دیکسون نشان داد که قدرت اتصالی لیگاند تری کلابندازول در حدود 9/1 برابر نسبت به آلبندازول بیشتر می باشد. همچنین با رسم نمودار لینویور-برک آنزیم لاکتوپراکسیداز در حضور غلظت های مختلف لیگاندهای تری کلابندازول و آلبندازول مکانیسم مهار آنزیم توسط این دو ترکیب به صورت غیر رقابتی (non-competitive) تشخیص داده شد. این نتیجه نشان می دهد که جایگاه اتصال دو ترکیب آلبندازول و تری کلابندازول بر روی آنزیم، جایگاهی به غیر از جایگاه فعال آنزیم می باشد. محاسبه ثابت‌های سرعت K1 (ثابت سرعت اتصال آنزیم به سوبسترای اول یا پراکسید هیدروژن) و ثابت K4 (ثابت سرعت اتصال کمپلکس آنزیم-سوبسترا به سوبسترای دهنده الکترون یا ABTS) نشان داد که هر دو ترکیب آلبندازول و تری کلابندازول با اتصال به آنزیم لاکتوپراکسیداز باعث تغییرات شدیدتری در مقادیر ثابت سرعت K4نسبت به ثابت سرعت K1 گردیده که نشانگر تاثیر منفی بیشتر این دو لیگاند بر روی جایگاه اتصال سوبسترای دوم (ABTS) نسبت به سوبسترای اول (H2O2) بر روی این آنزیم می باشد. با توجه به مصرف دو ترکیب آلبندازول و تری کلابندازول در درمان برخی بیماری های انگلی و با توجه به اثر مهاری این دو ترکیب بر روی آنزیم لاکتوپراکسیداز، باید احتیاط های لازم در میزان دوز مصرفی این دو ترکیب رعایت گردد.
Abstract: Lactoperoxidase enzyme (EC 1.11.1.7) is a glycoprotein from the peroxidase family that has antimicrobial and antioxidant properties in extraterritorial secretions such as saliva, tears and milk. This enzyme is activated in tear, salivary, nasal, bronchial and intestinal secretions and produces hypothyocyanates through oxidation of thiocyanate by hydrogen peroxide, so shows antibacterial, antifungal and antiviral properties. Lactoperoxidase plays an important role in protecting the mammary glands as well as the gastrointestinal (intestinal) in newborns. In this study, the effect of two compounds; albendazole and triclabendazole (anti-parasitic compounds derived from benzimidazole family), on some biochemical parameters of purified lactoperoxidase enzyme of bovine origin was investigated after determining the optimum enzymatic conditions. To confirm the purity of the enzyme, SDS-PAGE gel electrophoresis technique was used along with the standard protein marker based on Laemmli method. Spectrophotometry methods were also used to measure kinetic parameters of lactoperoxidase in the presence and absence of albendazole and triclabendazole. The results of SDS-PAGE electrophoresis of enzyme in the presence of standard protein marker confirmed the presence of a band in the gel with a molecular weight of about 78 kDa. Investigation of pH profile of enzymatic activity showed that the best pH for function of lactoperoxidase of bovine origin is equal to pH=6. Also, the results of Lineweaver–Burk plot of lactoperoxidase enzyme in the presence of two substrates ABTS and hydrogen peroxide showed that the Michaelis constant (Km) of enzyme for ABTS and Hydrogen peroxide substrates is 0.61mM and 0.029mM, and Vmax is 5.84 U/ml and 2.93 U/ml, respectively. Also, investigation of the effect of triclabendazole and albendazole on the activity of lactoperoxidase showed that both compounds inhibited the enzyme dose-dependent manner and this inhibitory effect did not follow the time-dependent mechanism. Also, by plotting the percentage of enzyme activity in the presence of different concentrations of triclabendazole and albendazole, the amount of IC50 (concentration of ligand that reduces enzyme activity by 50%) was calculated.The results showed that IC50 of triclabendazole was about 3.24 times lower than the albendazole. As a result, triclabendazole showed a more severe inhibitory effect on lactoperoxidase than albendazole. Also, the calculation of Ki (inhibition constant of enzyme-inhibitor complex) of triclabendazole and albendazole by plotting Dixon plot showed that the binding power of triclabendazole was about 1.9 times higher than the albendazole. Also, by plotting the Lineweaver–Burk plot of lactoperoxidase enzyme in the presence of different concentrations of triclabendazole and albendazole, the inhibition mechanism of the enzyme by these two compounds was detected as non-competitive. This result indicates that the binding site of the two compounds, albendazole and triclabendazole, on the enzyme is a site other than the active site of the enzyme. Calculation of rate constants; K1 (the rate constant of enzyme binding to first substrate or hydrogen peroxide) and K4 (the rate constant for the reaction between the enzyme–substrate complex and the electron donor or ABTS) showed that both albendazole and triclabendazole caused more drastic alteration in the constant values of K4 than the K1, indicating a greater negative effect of these two ligands on the binding site of second substrate (ABTS) than the first substrate (H2O2) on the enzyme. Therefore, when these two compounds were used for treatment of various illnesses, the dosage should be carefully determined to decrease the side effects.
The effect of albendazole and triclabendazole on biochemical parameters of lactoperoxidase under in vitro conditions
اصلی قره باغ،
حامد
تهيه کننده
طایفی نصرآبادی،
حسین
استاد راهنما
تبریز
