پ۲۵۴۴۲
per
ساخت ناقل CRISPR/Cas9 جهت هدفگیری ژن گرانول باند استارچ سنتاز سیب‌زمینی (Solanum tuberosum L.)
صفوره حسین پور استیار
کشاورزی
۱۴۰۰
۱۱۸ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
کشاورزی گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی
۱۴۰۰/۰۶/۲۸
چکیدهنشاسته پلی‌ساکارید غالب ذخیره‌ای در غده سیب‌زمینی است که از زنجیره‌های D-گلوکان آمیلوز و آمیلوپکتین تشکیل شده است. آمیلوز یک زنجیره خطی D- گلوکان با پیوندهای α(1-4) D-گلوکز است، در حالی که زنجیره های آمیلوپکتین دارای شاخه‌های α(1-6)می‌باشد. خواص فیزیکوشیمیایی نشاسته به شدت تحت تأثیر نسبت آمیلوز/آمیلوپکتین می‌باشد، که عامل تعیین کننده برای استفاده در برنامه‌های مهم صنعتی است. آنزیم گرانول باند استارچ سینتاز (GBSS) نقش محوری در آرایش و تجمع زنجیره‌های آمیلوز در ترکیب نشاسته غده‌های Solanum tuberosum دارد. در این پژوهش، کاست بیانی sgRNA اختصاصی GBSS، برای هدفگیری ژن GBSS از Solanum tuberosum ، کد کننده پروتئین مومی از گرانول باند استارچ سینتاز، طراحی و ساخته شد. فناوری CRISPR/Cas9 به عنوان یک سیستم ایمنی اکتسابی در اکثر باکتری‌ها و آرکئا وجود دارد. این سیستم از دو جز، اندونوکلئاز Cas9 و توالی RNAراهنما تشکیل شده است. برای هدف قرار دادن ژن GBSS ، بر اساس اطلاعات نوکلئوتیدی موجود در پایگاه داده NCBI، داده‌های توالی ژن هدف از GeneBank در پایگاه داده NCBI در دو سطح نوکلئوتیدی و آمینو‌اسیدی استخراج شد. gRNA اختصاصی با استفاده از ابزارهای CRISPRdirect و Tefor طراحی شده است. crRNA طراحی شده بین پروموتر AtU6 و توالی tracrRNA با استفاده از روش SOEing-PCR درج شد. وکتور همسانه‌سازی pTG19-T برای T/A کلونینگ کاست بیانی sgRNA اختصاصی GBSS استفاده شد. سویه E.coli DH5α به عنوان سلول مستعد باکتریایی برای ترانسفورماسیون ژنتیکی وکتور همسانه‌سازی pTG19-T نوترکیب با استفاده از روش TSS در نظر گرفته شد. کلنی‌های نوترکیب در محیط گزینشگر LB حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین (mg/l 100) غربالگری شدند و با آنالیز کلنی PCR تایید شدند. DNA پلاسمید کلنی مثبت انتخاب شده و توسط کیت استخراج پلاسمید طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. وکتور pTG19 نوترکیب حاوی کاست sgRNA با هضم آنزیمی EcoRI و توالی‌یابی تایید شد. کاست sgRNA توالی‌یابی شده در ناقل بیانی با واسطه CRISPR/Cas9 وکتور pFGC-pcoCas9 با استفاده از برش آنزیمیXbaI/EcoRI زیرهمسانه‌سازی شد. کلنی‌های نوترکیب در محیط انتخابی LB حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین (mg/l50) غربال شدند. کلنی‌های نوترکیب با استفاده از کلنی PCR تایید شد.
ب
Construction of CRISPR/Cas9-based Vector for Targetting Granule Bound Starch Synthase Gene from Sulanum tuberosum L.
حسین پور استیار،
صفوره
تهيه کننده
باغبان کهنه روز ،
نوروزی،
بهرام
مجید
استاد راهنما
استاد راهنما
تبریز
