پ۲۴۷۸۷
per
بررسی سطح بیان miR-138-5p و PD-L1 در بافت سرطانی و رده سلولی سرطان پستان و مطالعه اثر جایگزینی miR-138-5p بر مهار بیان PD-L1، رشد و مهاجرت سلولی و القای آپوپتوز در رده سلولی سرطان پستان
مینا رسول نژاد
علوم طبیعی
۱۴۰۰
۱۰۷ص.
سی دی
کارشناسی ارشد
ژنتیک مولکولی
۱۴۰۰/۰۴/۲۸
چکیده:microRNAها تنظیمکنندههای مهمی در فرآیندهای متعدد سلولی هستند و ارتباط تنگاتنگی با انواع سرطانها از جمله سرطان پستان دارند. ایمونوتراپی با روشهای مختلف مانند دستکاری نقاط کنترل ایمنی به عنوان یک روش پیشرفته و موفق در درمان سرطان شناخته شده است.مواد و روشها: در تحقیق حاضر، میزان بیان miR-138-5p و PD-L1 در نمونههای توموری سرطان پستان بررسی شد و در ادامه اثرات جایگزینی miR-138-5p بر میزان بیان PD-L1، رفتارهای بیولوژیکی سلولهای سرطان پستان و T cell exhaustion، از طریق تنظیم بیان PD-L1، مورد بررسی قرار گرفت. نمونه های سرطان پستان به همراه بافتهای مجاور نرمال و نیز ردههای سلولی سرطان پستان تهیه و آماده شدند. از تکنیکهای qRT-PCR و وسترن بلات برای بررسی سطح بیانmiR-138-5p ، PD-L1 و ژنهای مرتبط با مسیرهای مولکولی پایین دست استفاده شد. آنالیزهای MTT، تشکیل کلنی و تست خراش (scratch test) به ترتیب برای تعیین میزان زندهمانی، توانایی تشکیل کلنی و مهاجرت سلولهای ترنسفکت شده با miR-138-5p مورد استفاده قرار گرفت. همچنین برای ارزیابی میزان آپوپتوز و پیشرفت چرخه سلولی از فلوسایتومتری و رنگآمیزی با DAPI استفاده شد. در آخر، به منظور بررسی اثر بازدارندگی miR-138-5p بر T cell exhaustion، از همکشتی لنفوسیتهایT جدا شده از خون محیطی با رده سلولی سرطان پستان MDA-MB-231 ترنسفکت شده با miR-138-5p استفاده شد.نتایج: دادههای حاصل نشان داد میزان بیان miR-138-5p و PD-L1 به طور بسیار معنیداری در بافتهای توموری و نیز ردههای سلولی سرطان پستان به ترتیب کاهش و افزایش دارد. ترنسفکشن miR-138-5p mimic به رده سلولی MDA-MB-231 بیان PD-L1 را در سطحmRNA و نیز پروتئین کاهش داد. آنالیز MTT، تشکیل کلنی و نتایج وسترن بلات نقش مهاری miR-138-5p را بر رشد و تکثیر سلولی از طریق سرکوب مسیر PI3K/AKT نشان داد. همچنین miR-138-5p آپوپتوز را در سلولهای MDA-MB-231 از طریق افزایش بیانCaspase 9 ، Caspase 3 و p21 و نیز با افزایش نسبت BAX به Bcl-2 القا کرده و سلولها را در فاز sub-G1 چرخه سلولی متوقف میکند. همچنین اثرات ضدتهاجمی miR-138-5p در سلولهای MDA-MB-231 با تست خراش و با نتایج وسترنبلات از طریق کاهش بیان ژنهای MMP9، MMP2، Vimentin و افزایش بیان E-cadherin به اثبات رسید. همچنین نتایج ما نشان داد miR-138-5p از طریق سرکوب بیان PD-L1، T cell exhaustion را در سلولهای T مهار میکند.نتیجهگیری: نتایج تحقیقات ما نشان میدهد بازگرداندن سطح داخل سلولی miR-138-5p، به عنوان یک تومورساپرسور قوی، میتواند روش درمانی مناسبی برای درمان سرطان پستان باشد.
Background: MicroRNAs are considered as important regulators in multiple cellular processes and closely related to a variety of cancers including breast cancer (BC). Immunotherapy has been known as an advanced and successful procedure in cancer treatment using different methods such as modulating immune checkpoints.Methods: here we investigated the effects of miR-138-5p restoration on PD-L1 expression, BC biological behaviors and T-cell exhaustion. BC specimens and cell lines were provided and then qRT-PCR and western blotting were used to measure the expression of miR-138-5p, PD-L1 and other underlying genes. MTT assay, colony formation assay and scratch test were employed to determine proliferation, cloning and migration in miR-138-5p-transfected MDA-MB-231 cells respectively. Flow-cytometry and DAPI staining were used to investigate apoptosis rate and cell cycle development. At final, isolated T-cells from peripheral blood were co-cultured with transfected BC cells to investigate the effect of miR-138-5p on T-cell exhaustion.Results: qRT-PCR revealed down-regulation of miR-138-5p conversely, up-regulation of PD-L-1 in BC tissues and cell lines. Transfection of miR-138-5p into MDA-MB-231 cells inhibited PD-L1 expression. Western blotting, MTT and colony formation assays illustrated the anti-proliferative effect of miR-138-5p through down-regulating PI3K/AKT pathway. Also, miR-138-5p induced apoptosis in BC cells via up-regulating Caspase 9, Caspase 3, p21 and BAX/Bcl-2 ratio and arresting cell cycle at sub-G1 phase. Moreover, scratch test and western blotting indicated that miR-138-5p inhibits cell motility via targeting MMP2, MMP9 and vimentin but up-regulating E-cadherin. Finally, miR-138-5p inhibits T-cell exhaustion via suppressing PD-L1 expression in BC cells leading to disrupt PD-L1/PD-1 interaction and modulate effector cytokines in T-cells.
Thesis Title: Evaluation of expression levels of miR-138-5p and PD-L1 in breast cancer tissue and breast cancer cell line and study of the effects of miR-138-5p replacement on inhibiting the expression of PD-L1, cell growth and cell migration and induction of apoptosis in breast cancer cell line
رسول نژاد،
مینا
تهيه کننده
صفرعلیزاده،
برادران،
حسینپور فیضی،
بانان خجسته،
رضا
بهزاد
محمدعلی
سید مهدی
استاد راهنما
استاد راهنما
استاد مشاور
استاد مشاور
تبریز
