عنوان

تنوع زیستی و فیلوژنی گونه‌های فوزاریوم مرتبط با سنبله گندم و خویشاوندان وحشی آن در استان اردبیل با توالی‌صیابی چندژنی

‭۳۵۶۵پ‬

per

تنوع زیستی و فیلوژنی گونه‌های فوزاریوم مرتبط با سنبله گندم و خویشاوندان وحشی آن در استان اردبیل با توالی‌صیابی چندژنی

/مهدی داوری

تبریز : دانشگاه تبریز ، دانشکده کشاورزی

‮‭۱۷۰‬ص‬

چاپی

بیماری شناسی گیاهی

‮‭۱۳۹۱/۰۴/۲۵‬

تبریز : دانشگاه تبریز ، دانشکده کشاورزی

شیوع بیماری سوختگی فوزاریومی سنبله گندم ‮‭(FHB)‬ در استان اردبیل در چند سال اخیر روند افزایشی داشته و منجر به ایجاد خسارت اقتصادی به این محصول راهبردی از طریق کاهش عمکلرد و تولید زهرابه‌های قارچی شده است .به منظور بررسی تنوع زیستی گونه‌های فوزاریوم مرتبط با سنبله گندم و خویشاوندان وحشی آن در استان اردبیل، سنبله‌های مبتلا به بیماری ‮‭FHB‬ گندم و گل‌آذین‌های گندمیان وحشی طی سال‌های ‮‭۱۳۸۸‬ و ‮‭۱۳۸۹‬ از منطقه گندم-خیز مغان جمع‌آوری و پس از جداسازی قارچ‌های متعلق به جنس ‮‭Fusarium‬ با استفاده از محیطهای کشت اختصاصی و عمومی و خالص‌سازی با روش تک‌اسپور کردن از روی ویژگی‌های ریخت شناختی مورد شناسایی اولیه قرار گرفتند .برای مطالعات مولکولی، سه ژن‮‭۱- TEF‬، ‮‭RPB۲‬ و‮‭rDNA - ITS‬از کلیه جدایه‌ها توالی‌یابی شدند و پس از مقایسه با توالی‌های موجود در ‮‭GenBank‬ و پایگاه داده اختصاصی‮‭ID - FUSARIUM‬با استفاده از ابزار جستجوی ‮‭BLAST‬توالی‌های با بیشترین مشابهت دریافت شدند .رج‌بندی توالی‌ها و رسم درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرم‌افزار ‮‭Mega۵‬ انجام شد .بر اساس نتایج، ‮‭۱/۹۷‬ درصد از جدایه‌های به دست آمده از سنبله‌های بیمار گندم متعلق به کمپلکس گونه‌ای ‮‭Fusarium graminearum‬ و بقیه جزو کمپلکس گونه‌ای‮‭equiseti - F. incarnatum‬بودند .از ‮‭۲۳‬ گونه گرامینه وحشی ‮‭۱۵‬ گونه متعلق به شش کمپلکس گونه‌ای فوزاریوم به دست آمد که بیشترین فراوانی به ترتیب مربوط به گونه‌های‮‭F. incarnatum‬ ،‮‭F. equiseti‬ ، .‮‭F. graminearum s. str‬ و ‮‭F. proliferatum‬ بود .در بین این گونه‌صها، گزارش و توصیف چهار گونه‮‭F. brachygibbosum‬ ،‮‭F. torulosum‬ ، ‮‭F. commune‬ و ‮‭F. cf. reticulatum var. negundinis‬برای ایران جدید می‌باشد و تعدادی از این گیاهان به عنوان میزبان جدید گونه‌صهایی از جنس فوزاریوم در دنیا گزارش می‌شوند .همچنین به منظور مقایسه گونه‌صهای مولد بیماری ‮‭FHB‬ بین منطقه مغان و مناطق شمالی کشور، تعداد ‮‭۲۷‬ جدایه به دست آمده از سنبله‌ای بیمار گندم از نواحی مختلف استان گلستان نیز به همراه جدایه‌های مغان با استفاده از داده‌های ریخت شناختی و مولکولی به ترتیب بالا مورد شناسایی قرار گرفتند و بر این اساس، با شناسایی هشت گونه فوزاریوم، تنوع زیستی بالایی در بین جدایه‌های شمال مشاهده شد که ‮‭F. graminearum s. lato‬بالاترین فراوانی را در استان گلستان به خود اختصاص می‌داد.گونه مرکب ‮‭F. graminearum senso lato‬ تاکنون به عنوان گونه غالب در ایجاد این بیماری در اکثر مناطق گندم‌کاری دنیا از جمله ایران معرفی شده است .این گونه در حال حاضر بر اساس اطلاعات فیلوژنتیکی حداقل به ‮‭۱۵‬ گونه فیلوژنتیکی تقسیم شده است ولی تاکنون اطلاعات کافی از این تقسیم‌بندی جدید در ایران وجود نداشت .بنابراین در بخش دوم این تحقیق، به منظور شناسایی هم‌صزمان گونه‌های فیلوژنتیک و تیپ شیمیایی، ‮‭۱۳۹‬ جدایه متعلق به کمپلکس گونه‌ای ‮‭F. graminearum (FGSC)‬ به دست آمده از سنبله بیمار گندم منطقه مغان و استان گلستان با استفاده از روش تدوین ژنوتیپ چند ژن‌گاهی (,‮‭(MLGT multilocus genotyping‬ با فناوری لومینکس بررسی شدند .در این فناوری، ‮‭۴۱‬ کاوشگر برای تشخیص هم‌زمان دودمان‌های شناخته شده در این کمپلکس و پنج گونه نزدیک و زهرابه‌های قارچی عضو گروه تریکوتسن ‮‭B‬ استفاده می‌صشود .نتایج پژوهش نشان داد که تمام جدایه‌صها متعلق به ‮‭F. graminearum sensu stricto (lineage ۷)‬ هستند و فقط چهار جدایه منطقه مغان با هیچ‌کدام از دودمان‌صهای شناخته شده داخل این کمپلکس مطابقت نشان ندادند و احتمالا دودمان جدیدی را داخل ‮‭FGSC‬ تشکیل دهند .همچنین طبق نتاج لومینکس، ‮‭۶/۹۷‬درصد جدایه‌صهای منطقه مغان متعلق به تیپ شیمیایی ‮‭۱۵ADON‬ و بقیه متعلق به ‮‭۳ADON‬ بودند، در حالی‌که در استان گلستان، دو تیپ شیمیایی ‮‭NIV‬ و ‮‭۳ADON‬ به ترتیب ‮‭۷/۹۱‬ و ‮‭۳/۸‬ درصد جدایه‌ها را تشکیل می‌صدادند .تمام جدایه‌های ‮‭FGSC‬ به دست آمده از گل‌آذین گندمیان وحشی منطقه مغان نیز متعلق به .‮‭F. graminearum s. str‬ و تیپ شیمیایی ‮‭۱۵ADON‬ بودند .آگاهی دقیق از گونه‌صهای فیلوژنتیک و تیپ‌صهای شیمیایی جنس فوزاریوم می‌صواند در تولید ارقام مقاوم و سایر روش‌های مدیریتی بیماری ‮‭FHB‬ در هر منطقه مد نظر قرار گیرد .در بخش سوم این تحقیق با توجه به برخی مشکلات موجود در شناسایی مبتنی بر ریخت شناسی و نیز هزینه بالا و عدم دسترسی آسان به روش‌های مطمئن مانند توالی‌یابی، کارآیی رهیافت ‮‭RCA (Rolling Circle Amplification)‬ یا تکثیر دایره غلتان که در شناسایی گونه برخی بیمارگرهای انسانی در چند سال اخیر مورد استفاده قرار گرفته است، در شناسایی فوزاریوم بررسی گردید ‮‭RCA‬ .روشی سریع، حساس، مقرون به صرفه و بدون نیاز به توالی‌یابی است که در آن از کاوشگرهای قفلی ‮‭(Padlock probe)‬ استفاده می‌شود و محصول تکثیر یافته به راحتی روی ژل آگاروز قابل مشاهده است .برای این منظور، کاوشگر قفلی اختصاصی ‮‭FGSC‬ بر اساس چندشکلی ناحیه‮‭TEF‬- ‮‭۱‬پس از رج‌بندی بیش از ‮‭۱۰۰‬ توالی فوزاریوم ایرانی و توالی‌ای برگرفته از بانک ژن متعلق به کمپلکس های گونه‌صای مختلف از جمله ‮‭FGSC‬ طراحی گردید .سپس حدود ‮‭۶۵‬ جدایه متعلق به گونه‌های مختلف فوزاریوم شامل کمپلکس گونه‌ای ‮‭Fg‬ و حدود ‮‭۴۰‬ جدایه متعلق به جنس‌های نزدیک به فوزاریوم انتخاب و پس از تکثیر ناحیه‮‭۱- TEF‬، آمپلیکون‌ها با استفاده از رهیافت ‮‭RCA‬ مورد ارزیابی قرار گرفتند .با بررسی نتایج روی ژل آگاروز و نیز زیر نور ‮‭UV‬ معلوم شد که کاوشگر ‮‭FGSC‬ به صورت اختصاصی ‮‭DNA‬ هر ‮‭۱۵‬ دودمان شناخته شده در داخل این کمپلکس را تکثیر داده و هیچ واکنشی با گونه‌های متعلق به سایر کمپلکس‌های فوزاریوم و یا سایر جنس‌صهای قارچی مورد بررسی نشان نداد .به منظور راست‌آزمایی بیشتر کارآیی ‮‭RCA‬ در شناسایی صحیح گونه‌ها، این رهیافت در مورد ‮‭۵۰‬ جدایه فوزاریوم به‌دست آمده از سنبله‌های گندم و گندمیان وحشی شمال و شمال‌غرب ایران مورد آزمایش قرار گرفت و مطابقت کامل بین تشخیص ‮‭RCA‬ و نتایج ریخت‌صشناختی و توالی‌صیابی مشاهده شد .این تحقیق اولین مطالعه از شناسایی تنوع گونه‌های فوزاریوم همراه با گل‌آذین گندمیان وحشی، شناسایی گونه‌های متعلق به جنس فوزاریوم با استفاده توأم از داده‌های ریخت‌شناختی و توالی‌صیابی و بررسی گونه‌های داخل کمپلکس ‮‭Fg‬ و تیپ‌های شیمیایی آن با روش ‮‭MLGT‬ در ایران است .همچنین برای نخستین‌بار در دنیا استفاده از روش ‮‭RCA‬ در تشخیص گونه‌های یک قارچ بیمارگر گیاهی معرفی می‌شود.

In recent years, the incidence of Fusarium head blight disease of wheat (FHB) has increased in Ardabil province, which has resulted in economic losses to the grain industry by yield reduction and mycotoxin production. In present study, the biodiversity of the Fusarium species associated with heads of wheat and its wild relatives in Ardabil province was explored by using morphological and molecular data. For this propose, a total of 293 Fusarium isolates were recovered from wheat heads with disease symptoms and apparently healthy wild grass inflorescences during 2009-2010. Pure cultures were established using a single spore technique and monosporic isolates were subjected to morphological characterization using standard protocols. For molecular studies, sequence data were generated for genomic regions including ITS-rDNA region and parts of TEF-1? and RPB2 genes. The obtained sequences were subjected to Blast search at GenBank and FUSARIUM-ID databases, and sequences with high homology were obtained from GenBank and aligned with Mega5 and phylogenetic analysis were carried out by using the same program. Our results revealed Fusarium graminearum species complex as the dominant species (97/1 ) on wheat heads in this region and the rest of the isolates belonged to F. incarnatum-equiseti complex. Our results on the biodiversity of Fusarium species on wild grasses showed that 15 Fusarium species (belonging to six species complexes) were present on the inflorescences of 23 members of Poaceous weeds sampled in this study. F. incarnatum/F. equiseti complex was the most common species followed by F. graminearum s. str. and F. proliferatum. Among the identified species, F. brachygibbosum, F. torulosum, F. cf. reticulatum var. negundis and F. commune represent new records for the mycobiota of Iran. Some Poaceous plants are introduced as nova host for the genus Fusarium. We also included 27 Fusarium isolates obtained from infected heads of wheat in Golestan province in our study. Morphological and molecular characterization of these isolates revealed rich diversity among the Fusarium species in Golestan province, comprising eight Fusarium species and F. graminearum sensu lato as dominant species. graminearum s. lato is the most frequently isolated causal agent of FHB in the world as well as Iran. Phylogenetic species recognition with genealogical concordance has provided strong molecular genetic evidence that F. graminearum s. lato comprises at least 15 phylogenetically distinct species. There is huge paucity of knowledge on the identity of F. graminearum segregates in Iran. Hence, in order to facilitate simultaneous identification of phylogenetical species and chemotypes within in this species complex in this region, FGSC isolates were analyzed using Multilocus Genotyping (MLGT) assay in Luminex technology. In this technique, a multiplex PCR has developed to enable simultaneous determination of Fg complex members and five closely related species identity and trichothecene chemotype containing 41 probes. Based on the results, Fusarium graminearum s. str. (lineage 7) was the species most often encountered in relation to FHB (135 out of 139 isolates); four of the isolates obtained from Moghan area did not match with any of the already known lineages and probably represent a new lineage within the FGSC. Also, 97.6 of isolates gave a positive luminex signal on 15ADON (15-acetyldeoxynivalenol) and thus are potential 15ADON producers and the rest belonged to 3ADON (3-acetyldeoxynivalenol) chemotype. In contrast to northwest region, NIV and 3ADON chemotypes comprised 91/7 and 8/3 of isolates in North of Iran respectively. All poaceous weeds isolates belonged to F. graminearum s. str. and 15ADON.Considering the problems allied with the traditional methods in the identification of Fusarium spp. and often expensive techniques such as sequencing, there was an urgent need for development of of reliable, rapid and cost-effective techniques for simultaneous determination covering a broad and diverse range of Fusarium spp. Rolling Circle Amplification (RCA) of DNA is a sensitive and commodious method for the rapid identification of pathogenic fungi using padlock probes and without sequencing. Amplification products can be visualized on 1 agarose gel to verify the specificity of probe-template binding. For this purpose, we designed the padlock probe, FGSC based on polymorphisms in the TEF-1? gene after alignment of some 100 Iranian and universal sequences comprising lineages of the FGSC. The RCA reaction was performed on EF amplicons obtained from 105 isolates belonged to FGSC and other Fusarium complexes as well as some unrelated species. The RCA assays successfully amplified DNA of the target fungi (15 lineages within FGSC); while no cross reactivity with non-target DNA was observed. Subsequently designed probes were applied to 50 characterize isolates from Iranian wheat and wild grasses. The obtained results were in full agreement with the morphological and sequencing results.This is the first study on the biodiversity of Fusarium on wild grass heads in Iran. The combination of morphological and sequence data for the identification Fusaium species associated with wheat head blight is new for Iran. Study on phylogenetic species inside Fg complex and their chemotypes using MLGT is carried out for first time with Iranian isolates. Also for the first time in the world, effectiveness of RCA approach in the diagnosis of fungal plant pathogens is introduced.

Cereal

Chemotype

Moghan

Wild grass inflorescence

FGSC

Poaceae

داوری، مهدی

بابای اهری، اسداله، استاد راهنما

ارزنلو، مهدی، استاد راهنما

زارع، رسول، استاد مشاور

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی