۲۳۱۴۱پ
per
کلونینگ و بیان ژن پروتئین SP۱۵ بزاق پشه خاکی ناقل انگل لیشمانیا ماژور(فلبوتوموس پاپاتاسی) در باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس به صورت ترشحی بر روی دیواره و بررسی اثر محافظت بخشی آن در موشBALB/c
Cloning and expression of SP۱۵ gene of salivary gland vector of Leishmania major as cell-wall in Lactococcus lactis and assessment of protection in BALB/c mice
/الهه داورپناه
: علوم طبیعی
، ۱۳۹۸
، میرزائی
۲۲۰ص
چاپی - الکترونیکی
دکتری
زیست شناسی گرایش ژنتیک مولکولی
۱۳۹۸/۱۱/۲۰
تبریز
لیشمانیوز پوستی یک بیماری انگلی وابسته به ناقل است که توسط پشه خاکی های آلوده به انگل لیشمانیا منتقل می شود .بزاق پشه خاکی) که به همراه انگل به محل گزش منتقل می شود (حاوی پروتئین های متعددی است که منجر به توسعه بیماری می شوند .با این وجود تعداد کمی از پروتئین های ایمنی زای بزاق بعنوان واکسن های محافظت بخش تحت بررسی قرار گرفته اند SP۱۵ .یکی از پروتئین های ایمنی زا در بزاق پشه خاکی فلبوتوموس پاپاتاسی است که منجر به ایجاد حفاظت بر علیه انگل لیشمانیا ماژور می گردد .در این مطالعه از باکتری غیر بیماریزای زنده لاکتوکوکوس لاکتیس به عنوان سیستم انتقال آنتی ژن به موش های BALB/c و بررسی اثر حفاظت بخشی آن بر علیه عفونت لیشمانیا ماژور استفاده شده است .بررسی های in silico بر روی پروتئینSP۱۵ ، حضور یک اپی توپ ایمنی زای عرضه شونده توسط هر دو مولکولHLA - IوII - HLAبه ترتیب به لنفوسیت های+CD۸- T و+CD۴- T را نشان داد .بنابراین این پروتئین توانایی تحریک هر دو گروه لنفوسیت ها را دارد .ژن ترکیبیegfp - sp۱۵در پایین دست پپتید راهنما PrtP در پلاسمید pNZ۸۱۲۱ کلون گردید که منجر به بیان پروتئین بر روی دیواره سلولی باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس شدEGFPcwa). -SP۱۵- (L. lactisتأیید بیان پروتئین در باکتری به وسیله وسترن بلات، میکروسکوپ فلورسانس و فلوسایتومتری انجام شد .همچنین به منظور تأیید حضور پروتئین بر روی دیواره سلولی باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس نوترکیب، از روش های وسترن بلات و الایزای کل سلولی بر روی فراکشنهای مختلف جدا شده از باکتری استفاده گردید .علاوه بر این، بیان پروتئین مستقیما توسط میکروسکوپ TEM تأیید شد .سپس موش های BALB/c سه بار با فاصله زمانی دو هفته با واکسن کاندید واکسینه شدند .دو هفته پس از آخرین نوبت دریافت واکسن) آزمون کوتاه مدت (و شش ماه بعد) آزمون بلند مدت (موش ها با~۲ ۱۰۵پروماستیگوت فاز ایستایی لیشمانیا ماژور به همراه SGH برای هر موش چالش شدند .بعد از واکسیناسیون و قبل از چالش پاسخ ایمنی سلولی نشان داد که میزانIFN - و۱۷ - ILدر گروه واکسینه شده باEGFPcwa -SP۱۵- L. lactisبه طور معناداری بالاتر از گروه های کنترل است .بعد از چالش موش ها با لیشمانیا ماژور وSGH ، این گروه کمترین میزان تورم کف پا و بار انگلی و بالاترین میزان نسبت IgG۲a/IgG۱ را نشان داد .بررسی پروفایل سایتوکاینی نیز نشان داد که واکسیناسیون با باکتریEGFPcwa -SP۱۵- L lactisترشحIFN - و۱۷ - ILرا افزایش و تولیدIL - ۵و۱۰ - ILرا کاهش می دهد که بیانگر تحریک پاسخ Th۱ و کنترل بیماری در موشهای آلوده می باشد .آزمون بلند مدت (۶ ماه پس از ایمنی زایی (نیز نشان داد که تولیدIFN - و۱۷ - ILدر گروه واکسینه شده با باکتریEGFPcwa -SP۱۵- L. Lactisبه طور معناداری بیشتر از آزمون کوتاه مدت می باشد .از طرف دیگر، میزان۱۰ - ILتولید شده در گروه واکسینه شده نسبت به سایر گروه ها بسیار کمتر بود .بعد از چالش میزان تورم کف پا و بار انگلی، نتایج مشابهی را با آزمون کوتاه مدت نشان داد .علاوه بر آن، در گروه واکسینه شده هر دو سایتوکاینIFN - و۱۷ - ILبه میزان بیشتری نسبت به گروه های کنترل تولید گردید .بنابراین براساس یافته های بدست آمده، پاسخ ایمنی سلولی ایجاد شده توسط واکسن کاندید تا ۶ ماه پس از واکسیناسیون نیز پایدار می باشد
105/mouse stationary phase L. major promastigotes plus Salivary Gland Homogenate (SGH). Early after immunization and before challenge cellular response validated significantly higher levels of IFN- and IL-17 in L. lactis-SP15-EGFPcwa vaccinated group compared to controls. After challenge of mice with L. major and SGH, this group had the lowest footpad swelling and parasitic load and produced the highest IgG2a/IgG1 ratio. After challenge, cytokine profile analysis also showed that vaccination with L. lactis-SP15-EGFPcwa increased IFN- and IL-17 production and reduced IL-5 and IL-10, which indicated the stimulation of Th1 response and control of the disease in infected mice. Long-term experiment (Six months after immunization) also showed that the production of IFN- and IL-17 in L. lactis-SP15-EGFPcwa vaccinated group was significantly higher than short-term experiment. On the other side, IL-10 production in the vaccinated group was much lower than in the other groups. After challenge the rate of footpad swelling and parasitic load showed the similar results with the short-term experiment. Also both IFN- and IL-17 were produced higher in L. lactis-SP15-EGFPcwa vaccinated group than controls. Therefore, based on the findings, the cellular immune response induced by the candidate vaccine is also stable up to 6 months after vaccination2~ Cutaneous leishmaniasis is a vector-borne disease transmitted by Leishmania infected sand flies. Sand fly saliva (co-injected with parasite in the skin) contains several proteins that can promote the disease. However a few immunogenic proteins of the saliva have also been evaluated as protective when used in vaccine formulations. SP15 is one of the immunogenic proteins in Phlebotomus papatasi sand fly saliva which leads to protection against Leishmania (L.) major parasite. In this study, live non-pathogenic Lactococcus lactis (L. lactis) delivery system was used to immunize BALB/c mice and evaluate its protective potential against L. major infection. In silico analysis on SP15 protein revealed that an immunogenic epitope is presented by both HLA-I and HLA-II to T-CD8+ and T-CD4+ lymphocytes, respectively. Thus, this protein potentially stimulates both groups of lymphocytes. The sp15-egfp fusion gene was then cloned downstream of PrtP signal peptide in pNZ8121 vector for L. lactis cell wall expression (L. lactis-SP15-EGFPcwa). Confirmation of the protein expression was done by Western blot, immunofluorescence microscope and flow cytometry. Also, in order to verify the expression of protein on L. lactis cell wall, different fraction of bacteria were separated and then evaluated using Western blot and whole cell ELISA. In addition, expression of protein was directly confirmed by TEM microscopy. Next, BALB/c mice were immunized three times (two weeks interval) with candidate vaccine. Two weeks after the last booster (short-term evaluation) and 6 months later (long-term evaluation) mice groups were challenged with
Cloning and expression of SP۱۵ gene of salivary gland vector of Leishmania major as cell-wall in Lactococcus lactis and assessment of protection in BALB/c mice
داورپناه، الهه
Davarpanah, Elaheh
صفرعلیزاده، رضا، استاد راهنما
طاهری، طاهره، استاد راهنما
رأفتی، سیما، استاد مشاور
سید، نگار، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
