۲۳۰۶۱پ
per
ساخت ناقل بیانی CRISPR/Cas۹ جهت هدفگیری ژن uxs درخت تبریزی (.Populus nigra L از طریق پی‌سی‌آر سوینگ)
Construction of CRISPR/Cas۹-based Expression Vector for Targetting UXS Gene from Populus nigra L. by SOEing PCR
/الهه کاوسی
: کشاورزی
، ۱۳۹۸
، میرزائی
۹۱ص
چاپی - الکترونیکی
کارشناسی ارشد
بیوتکنولوژی کشاورزی
۱۳۹۸/۱۱/۱۱
تبریز
تغییر ساختار دیواره سلولی گیاهان برای اهداف متنوع کاربردی هدفگیری می‌شود .سلولز به‌عنوان تاروپود این دیواره، یک پلی ساکارید هموپلیمری خطی گلوکان است .جز مهم بعدی در دیواره سلولی همی‌سلولز و لیگنین هست، وجود قندهایL -آرابینوز در همی‌سلولز نزدیک به ۵۰ درصد محتوی آن را در دیواره سلولی ثانویه به خود اختصاص می‌صدهد که منجر به اتصال مستحکم سلولز و لیگنین به همی‌صسلولز شده و غلاف‌صبندی همی‌سلولز را در اطراف سلولز تحکیم می‌بخشد و از این طریق باعث کریستالیزه شدن بالای سلولز ، دشواری استخراج و افزایش هزینه‌های تولید آن می‌گردد .در تحقیق حاضر جهت تغییر ساختار دیواره سلولی از درخت صنوبر تبریزی یا شالک (L. Populus nigra) به دلیل رشد سریع و قابلیت تولید مقادیر بالای لیگنوسلولز استفاده شد .به طوری که بر اساس مطالعات صورت گرفته با حذف حداقل ۵۰ درصد محتوی همی‌سلولز می‌صتوان دسترسی به سلولز را افزایش داد .دراین تحقیق برای کاهش کریستالیزه شدن همی‌صسلولز، طراحی و ساخت کاست از کار انداز ژن UDPگلوکورونات دکربوکسیلاز ((uxsصصص به روش Crispr/Cas۹ انجام گرفت .بدین منظور توالی‌صهای مربوط به ژن درگیر در مسیر سنتز همی‌سلولز در صنوبر از بانک نوکلئوتیدی موجود در پایگاه داده‌ص NCBI دانلود شد .در این بررسی ابتدا نواحی مشابه بررسی و برای اطمینان خاطر از هدف گیری ژن uxs جهت طراحی نعیین شد .برای طراحی gRNA از نرم افزار CRISPRdirect و برای بررسی‌های نواحی غیر هدف از نرم افزار Tefor استفاده گردید .پلاسمید پایه که قبلا طراحی و تولید شده بود برای این تحقیق استفاده گردید .این پلاسمید حاوی راه انداز U۶ آرابیدوپسیس و RNA داربستی اتصالی به Cas۹ می باشد و جهت درج gRNA اختصاصی ژن uxs از طریق روش سوینگ پی سی آر از آن استفاده شد .اجرای سوینگ پی سی آر جهت درج توالی sgRNA مابین توالی راه انداز U۶ آرابیدوبسیس و توالی اسکافلد ,tracrRNA سه جفت آغازگر مستقیم و معکوس شاملgRNA_R- U۶ promoter_F/U۶promoter،gRNA_F/Scafold_R - U۶promoterو U۶promoter_F/Scaffold_R طراحی شدند .با استفاده از این روش طی سه مرحله PCR ابتدا ناحیه راه انداز همراه با gRNA و سپس ناحیه اسکافولد همراه با gRNA تکثیر شدند و در خاتمه طی یک واکنش PCR نهایی دو محصول با هم مخلوط و قطعات تکثیر یافته مراحل قبلی به یکدیگر متصل شدند .به این ترتیب ناحیه gRNA مربوط به ژن هدف مابین توالی راه انداز و اسکافولد قرار گرفت .فراورده حاصل از آخرین PCR جهت تایید صحت توالی در ناقل pUC۱۹ در باکتری E. coli سویه DH۵ همسانه سازی شد .پس از تایید حضور قطعه در پلاسمیدgRNA - pUCجهت توالی یابی نهایی به شرکت بیومجیک ارسال گردید .صحت نتایج حاصل از توالی با توالی طراحی شده از طریق همردیفی نوکلئوتیدی تایید و در پایان کاست ژن هدف در ناقل اختصاصی کریسپرpcoCas۹ - pFGCاز طریق برش و اتصال آنزیمی ناقل دهنده و گیرنده در باکتری E. coli سویه DH۵ زیرهمسانه سازی و صحت همسانه سازی به کمک برش آنزیمی ناقل نهایی تایید شد
It is interesting for researchers to modify the cell wall structure of plants for a variety of purposes. Cellulose as a cell wall sceleton is a linear glucan homopolymer polysaccharide. The next major component in the hemicellulose cell wall and lignin is the presence of L-arabinose sugars in hemicellulose accounting for approximately 50 of its content in the secondary cell wall, leading to a strong binding of cellulose and lignin to the hemicellulose and sheath. The consolidation of hemicellulose around cellulose strengthens the high crystallization of cellulose and makes it difficult to extract and increase production costs. In the present study, black poplar or Schalk (Populus nigra L.) was used because of their rapid growth and ability to produce high amounts of lignocellulose. Several studies have shown that removing at least 50 of hemicellulose content can increase cellulose availibity for industrial pruposes. One of the important strategies to reduce the crystallization of hemicellulose is to knock out the UDP glucuronate decarboxylase (UXS) gene in poplar using CRISPR/Cas9 system. The system has two components: Cas9 endonuclease derived from Streptococcus pyogenes and the other is a guide RNA sequence. To target the uxs1 gene based on the nucleotide sequences from NCBI database, the sequences of the genes involved in the hemicellulose synthesis pathway in poplar were investigated. In this study, we first identified similar regions to ensure that uxs gene was targeted for the design and selection of the target region. CRISPRdirect software was used to design the gRNA and Tefor software was used to investigate non-target regions. In this study, pre-synthesized cassettes containing Arabidopsis U6 driver and Cas9 scaffolding RNA were used to insert gRNA through the SOEing PCR method. Target gene cassette was validated by sequencing. The Cassette was subcloned in the specific expression vector pFGC-pcoCas9 by double digestion
Construction of CRISPR/Cas۹-based Expression Vector for Targetting UXS Gene from Populus nigra L. by SOEing PCR
کاوسی، الهه
Kavusi, Elaheh
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
