۲۳۰۳۶پ
per
بررسی اثر ناک اوت ژن Prkdcبا استفاده از سیستم CRISPR/Cas۹ در سلول‌های بنیادی جنینی
Evaluation effect the Knockout of the Prkdc gene using by CRISPR/Cas۹ system in embryonic stem cell
/فرزاد سلیمانی
: علوم طبیعی
، ۱۳۹۸
، میرزائی
۸۴ص
چاپی - الکترونیکی
دکتری
ژنتیک مولکولی
۱۳۹۸/۰۷/۲۱
تبریز
پروتئینPKcs - DNAکه توسط ژن Prkdc کد می‌صشود، نقش کلیدی در مسیر اتصال انتهاهای غیر همولوگ (NHEJ) در طی ترمیم شکست دو رشته‌صای DNA ایفا می‌صکند .این پروتئین هم‌صچنین با فسفریلاسیون پروتئین‌های دخیل در مسیر ترمیمی نوترکیبی همولوگ (HR) در تنظیم آن دارای عملکرد است .علاوه بر نقش در ترمیم شکست دو رشته‌صایDNA ،PKcs - DNAدر فرایندصهای زیستی دیگری نظیر تنظیم رونویسی، پایداری تلومر، آپوپتوز و متابولیسم نقش حیاتی دارد .بیانPKcs - DNAدر طی تمایز سلول‌صهای بنیادی جنینی موشی افزایش پیدا می‌صکند .به منظور بررسی نقشPKcs - DNAدر پرتوانی سلول‌صهای بنیادی جنینی موشی و تمایز in vitro به سه لایه زایا اکتودرم، مزودرم و اندودرم تحت شرایط فیزیولوژیک نرمال، در این مطالعه با استفاده از سیستم CRISPR/Cas۹ یک رده سلولی بنیادی جنینی موشی با حذف هر دو آلل ژن Prkdc تولید شد .به منظور حذف بیان ژن Prkdc در اگزون شماره یک دو sgRNA طراحی شد و سپس sgRNA در وکتور Px۴۵۹v۲ کلون شد .وکتورصهای حاویsgRNA صها به داخل سلول‌صهای بنیادی جنینی موشی ترانسفکت شد .سپس یک رده سلولی که در آن هر دو آلل Prkdc حذف شده بود جداسازی شد و اثر حذف Prkdc بر ویژگی‌صهای محتلف سلول‌صهای بنیادی جنینی موشی سنجیده شد .نتایج نشان داد که سلول‌صهای/- Prkdc- دارای مرفولوژی، چرخه سلولی و فعالیت آلکالین فسفاتازی طبیعی سلول‌صهای بنیادی جنینی هستند .حذف ژن Prkdc باعث افزایش بیان ژن‌صهای کلیدی پرتوانی از جملهOct۴ ، Sox۲ و Nanog می‌صشود .علاوه بر این، در این مطالعه مشخص شد که بیان چندین مارکر ژنی لایه‌های زایا در پاسخ به حذف Prkdc تغییر پیدا می‌صکند .در مجموع داده‌صهای به دست آمده پیشنهاد کننده نقش احتمالی Prkdc در تمایز و تکوین است
Prkdc encodes for the catalytic subunit of the DNAdependent protein kinase (DNA-PKcs) playing a key role in non-homologous end joining pathway during DNA double strand break repair and also influencing the homologous recombination (HR) repair system by phosphorylation of proteins involved in HR. In addition, Prkdc has other critical functions in biological processes, such as transcriptional regulation, telomere stability, apoptosis, and metabolism. DNAPKcs upregulates during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs). To address the potential role of Prkdc in mESCs pluripotency and in vitro differentiation into ectoderm, mesoderm, and endoderm germ layers under normal physiological conditions, a bi-allelic Prkdcknockout cell line was generated in the present study by employing CRISPR/Cas9 system. For this purpose, two sgRNA were designed and were into PX459v2 vector. Then, plasmids containing sgRNA were transfected into mouse embryonic stem cells cells with lipofectamine LTX. A cell line the lack of Prkdc expression was isolated, and subsequently, its potential role in stemness and development was studied. The results of the study showed that the expression of pluripotencyassociated genes, including Nanog and Sox2 were overexpressed in the biallelic Prkdcknockout cell line. Also, biallelic Prkdcknockout cell line was shown to have typical mESCs cell morphology, cell cycle distribution, and alkaline phosphatase activity. Furthermore, the results of the study revealed that the expression of several germ layer markers is modulated in Prkdcknockout lines. In conclusion, the findings of our study demonstrated the role of Prkdc during differentiation and development of ESCs
Evaluation effect the Knockout of the Prkdc gene using by CRISPR/Cas۹ system in embryonic stem cell
سلیمانی، فرزاد
Soleimani, Farzad
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
