۲۱۴۱۹پ
per
بررسی تولید پلمباژین در کشت سلول و ریشه موئین.Plumbago europaea L
Study of Plumbagin Production in Suspension Cell and Hairy Root Cultures of Plumbago europaea
/مینا بیگ محمدی
: علوم طبیعی
، ۱۳۹۸
، میرزائی
۲۳۸ص
چاپی - الکترونیکی
دکتری
زیست شناسی گرایش فیزیولوژی گیاهی
۱۳۹۸/۰۳/۰۸
تبریز
Plumbago europaea :به دلیل داشتن متابولیت ثانویه ارزشمند پلمباژین و خواص درمانی متعدد نظیر خاصیت ضد سرطانی، ضد میکروبی و ضد مالاریا اهمیت دارویی بسیاری پیدا کرده است .در پژوهش حاضر، تولید در شیشه پلمباژین در این گیاه برای نخستین بار مورد بررسی قرار گرفت .در این مطالعه به منظور باززایی این گیاه، برگ‌ص و ساقه از گیاهان استریل سه هفته‌صای جدا شدند و به عنوان ریزنمونه در تیمارهای مختلف شامل هورمون‌صهای NAA، IAA، BAP وTDZ استفاده شدند .بالاترین درصد باززایی مستقیم و بیشترین میانگین تولید گیاهچه در ریزنمونه‌صهای ساقه و برگ، در ترکیب هورمونی حاوی ۵/۰ میلی‌صگرم بر لیتر TDZ و ۱/۰ میلی‌صگرم بر لیتر IAA بدست آمد .بالاترین میزان ریزازدیادی در ریزنمونه گره در تیمار ۵/۰ میلی‌صگرم بر لیتر TDZ اتفاق افتاد .برای القای ریشه نیز از تیمار هورمونی۵/۰ - ۱میلی‌صگرم بر لیتر IBA یا NAA در محیط MS۲/۱ استفاده شد .همچنین محیط کشت بهینه برای کشت کالوس و کشت سلولی، محیط MS حاوی ۱ میلی‌صگرم در لیتر۲,۴- Dو ۵/۰ میلی‌صگرم در لیتر Kin بود .در مطالعه حاضر برای انجام تراریختی، از ریزنمونه‌صهای برگ، ساقه و هیپوکوتیل گیاهان سه هفته‌صای استریل و سویه‌صهای آگروباکتریوم صA۴ ، A۱۳، ATCC۱۵۸۳۴ و MSU۴۴۰ استفاده شد .بالاترین میزان تراریختی با استفاده از سویه آگروباکتریوم رایزوژنز MSU۴۴۰در ریزنمونه ساقه با دوره هم‌صکشتی ۴۸ ساعت و محیط هم‌صکشتی حاوی ۱۰۰ میکرومولار استوسیرینگون بدست آمد .بهترین محیط برای رشد ریشه موئین و تولید پلمباژین، محیط کشت MS ۲/۱ مایع حاوی ویتامین‌صهای B۵و ۳۰ گرم در لیتر ساکارز بود .کشت سلولی و ریشه موئین که در شرایط تاریکی رشد کرده بودند، عملکرد بالاتری را نسبت به شرایط فتوپریود دارا بودند .بیشترین مقدار پلمباژین به ترتیب در کشت ریشه موئین سپس کشت سوسپانسیون سلولی و در آخر کشت کالوس تولید شد .پس از بهینه‌صسازی محیط کشت سوسپانسیون سلولی و ریشه موئین، اثر غلظت‌صهای مختلف الیسیتورها) اسیدسالسیلیک، متیل جاسمونات، عصاره مخمر و کیتوزان (بر میزان بیوماس، تولید پلمباژین و بیان ژن PKS در کشت سوسپانسیون سلولی و ریشه موئین بررسی شد .در غلظت بهینه الیسیتورها، میزان رشد سلولی، میزان پلمباژین و بیان ژن مسیر بیوسنتزی پلمباژین در زمان‌صهای۱ ، ۳ و ۶ روز بعد از افزودن به محیط مورد بررسی قرار گرفت .رشد سلول‌صهای P. europaea تحت تأثیر الیسیتورهای اسید سالیسیلیک، متیل جاسمونات، کیتوزان در غلظت‌صهای بالا به طور معنی‌صداری کاهش یافت و بیشترین میزان کاهش رشد تحت تأثیر کیتوزان در غلظت ۳۰۰ میلی‌صگرم بر لیتر مشاهده شد .تمامی الیسیتورهای مورد استفاده در سوسپانسیونهای سلولی و ریشه موئین موجب افزایش تجمع پلمباژین شدند که بالاترین مقدار پلمباژین، ۳ روز پس از اعمال تیمار با الیسیتور کیتوزان (۱۵۰ میلی‌صگرم بر لیتر (در کشت ریشه موئین نسبت به شاهد در همین زمان به دست آمد .کیتوزان توانست ۲۴ ساعت پس از اعمال تیمار در کشت سوسپانسیون سلولی موجب افزایش پلمباژین تا ۲/۷ برابر نسبت به شاهد شود که با گذشت زمان این مقدار کاهش یافت .افزودن کیتوزان به کشت ریشه موئین و کشت سوسپانسیون سلولی منجر به آزاد شدن پلمباژین به محیط شد و این پدیده در الیسیتورصهای دیگر اتفاق نیفتاد .در پژوهش حاضر، ریشه‌صهای موئین ایجاد شده برای تولید پلمباژین مؤثرتر بودند .به منظور افزایش تولید پلمباژین و بهبود بازیابی پلمباژین از محیط کشت در کشت ریشه موئین فرآیند تلفیقی اعمال محرک کیتوزان و افزودن جاذبXAD - ۷انجام گرفت .افزودنXAD - ۷به کشت‌ص ریشه موئین، دو روز پس از تیمار با کیتوزان تولید پلمباژین را افزایش داد که به ترتیب ۵۵/۱ و ۵/۵ برابر بیشتر از نمونه تحت تیمار با کیتوزان و ریشه‌صهای تیمار نشده بود .آنچه در این مطالعه مشاهده شد، تحریک پذیری بیشتر سلول‌صهای سوسپانسیون سلولی نسبت به ریشه موئین بود، با اینحال مقدار پلمباژین حاصل از ریشه‌صهای موئین بیشتر از کشت سوسپانسیون سلولی مورد مطالعه بود .بررسی بیان ژن PKS با تکنیکtime PCR - Realنشان داد که بیان ژن PKS به طور معنی‌صداری تحت تأثیر الیسیتورها افزایش یافت .نتایج این پژوهش نشان دادPKS نقش مهمی در افزایش تولید پلمباژین تحت تأثیر الیسیتورها دارد .بر اساس این نتایج پیشنهاد می‌صشود با افزایش بیان ژن PKS می‌صتوان تولید بیشتر پلمباژین در کشت سلول و ریشه موئین گیاه P. europaea را القا نمود .با توجه به نتایج بدست آمده، نوع کشت، غلظت و نوع الیسیتور، مدت زمان تماس با الیسیتور اهمیت زیادی در فرآیند تحریک دارد
MS-B5 liquid medium incubated in the dark resulted in the optimal biomass production of transformed roots with 3.2 mg/g DW plumbagin accumulation. The highest plumbagin content was obtained by hairy root culture, followed by cell suspension culture. Moreover, plumbagin accumulation in the root of seedlings was higher than that of the aerial part. After the optimization of the hairy root and suspension culture, the effect of different concentrations of elicitors (salicylic acid, methyl jasmonate, yeast extract, and chitosan) on the biomass, plumbagin production and PKS gene expression were investigated. At the optimal concentration of elicitors, the cell growth rate, plumbagin production and the expression of PKS were evaluated after 1, 3 and 6 days. The cell growth of P. europaea was decreased by salicylic acid, methyl jasmonate, and chitosan at the high concentrations. On the other hand, all of the elicitors used in cell suspensions and hairy roots increased the accumulation of plumbagin. In hairy root cultures, the maximum plumbagin production induced by chitosan was higher than control cells after 3 days. Intriguingly, the P. europaea cell suspension culture treated with chitosan exhibited 7.2 fold higher than control cells 1 day after treatment, which decreased over time. Adding chitosan to hairy root culture and cells suspension culture led to the release of plumbagin into the media. The production of plumbagin was studied using combined chitosan elicitation and in situ adsorption using XAD-7 as adsorbent. After chitosan treatment for 48 h, the addition of XAD-7 enhanced plumbagin production which was 1.5 and 5.5- fold higher than chitosan treated and untreated hairy root culture, respectively. Accordingly, chitosan elicitation in combination with XAD-7 was a suitable approach for production of plumbagin. Although suspension cells had higher irritability than hairy root, the amount of plumbagin obtained from hairy roots was higher than cell suspension culture. Gene expression study showed that expression of PKS gene was significantly increased under the influence of elicitors. Therefore, PKS gene plays an important role in the increasing plumbagin production by elicitors. According to the obtained results, type of culture, type of elicitor, elicitor concentration and duration of elicitor exposure are important parameters in the elicitation process ╜ MS media. The optimum medium for callus and cell suspension was MS containing 1 mg/l 2, 4-D and 0.5 mg/l Kin. The leaf, hypocotyl and stem explants from in vitro grown seedlings were inoculated with bacterial strains (A4, ATCC15834, MSU440 and A13) for transformation. The best response (69.3 ) was achieved after 7-9 days by inoculating of stem explants with A. rhizogenes MSU440 strain followed by 2 days co-cultivation period with 100 M acetosyringone. ╜ Plumbago europaea L. is the main source of plumbagin which is a well-known pharmacological active compound. In the present work, the production of plumbagin in suspension cell and hairy root cultures of Plumbago europaea was studied. For regeneration of plants, leaves and stems explants were isolated from the 3-week-old seedlings. The highest shoot regeneration was happened under treatments of 0.5 mg/l TDZ, 0.1 mg/l IAA using stem explants. The highest micropropagation occurred in 0.5 mg/l TDZ treatment. For root induction, 0.5-2 mg/l IBA or NAA was used in MS and
Study of Plumbagin Production in Suspension Cell and Hairy Root Cultures of Plumbago europaea
بیگ محمدی، مینا
Beigmohamadi, Mina
موافقی، علی، استاد راهنما
شرفی، علی، استاد راهنما
جعفری، ثمینه، استاد مشاور
دانافر، حسین، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
