۲۱۰۷۳پ
per
تثبیت آنزیم آلفا آمیلاز روی گرافن اکسید در ماتریکس کرایوژل آلژینات
Immobilization of alpha-amylase on graphene oxide in alginate cryogel matrix
/زینب بابایی
: کشاورزی
، ۱۳۹۷
، میرزائی
۶۹ص
چاپی - الکترونیکی
کارشناسی ارشد
علوم وصنایع غذایی گرایش زیست فناوری
۱۳۹۷/۰۶/۱۹
تبریز
به طور کلی آنزیم ها بیوکاتالیست هایی هستند که واکنش های شیمیایی را در سلول و ارگانیسم ها کاتالیز می کنند و در فرایند های غذایی، تبدیلات زیستی و تولید بیوسنسور ها کاربرد فراوانی دارند .آنزیم آلفا آمیلاز از مهمترین آنزیم ها در بیوتکنولوژی صنعتی محسوب می شود و اهمیت آن به دلیل کاربرد گسترده این آنزیم در صنایع مختلف به ویژه تولید شیرین کننده ها می باشد .آنزیم در حالت آزاد به تغییر شرایط اپتیمم حساس بوده و حیات کاتالیستی کوتاهی دارد .تثبیت به عنوان راه حلی برای این چالش، می تواند نقش به سزایی در کاهش هزینه ها برای کاربرد صنعتی آنزیم به خصوص آلفا آمیلاز داشته باشد .تثبیت آنزیم شامل اتصال آنزیم به بستر و یا گنجاندن آنها در ماتریکسی از بستر پلیمری می باشد .در میان بسترهای مختلف استفاده از مواد نانو ساختار از جمله گرافن اکسید به دلیل داشتن نسبت سطح به حجم بالا و اندازه منافذ مطلوب در تحقیقات کاربردی اخیر مورد تاکید قرار گرفته است .یکی از بهترین روش ها جهت بازیافت آنزیم های تثبیت شده از مخلوط واکنش و جداسازی آنها به منظور استفاده مجدد، کاربرد تکنیک کرایوژل می باشد .کرایوژل ساختار متخلخلی است که در نتیجه خشک کردن انجمادی سوسپانسیون محلول کلوییدی پلیمرهای ژل ساز بدست می آید .سدیم آلژینات یکی از پلیمر هایی است که در ساخت کرایوژل کاربرد فراوان دارد .با این تفاسیر هدف از این تحقیق تثبیت آنزیم آلفا آمیلاز روی بستر گرافن اکسید در ماتریکس کرایوژل آلژینات می باشد .بدین منظور، ابتدا گرافن اکسید سنتز و توسط گلوتارآلدهید فعال شد سپس آنزیم آلفاآمیلاز در غلظت های مختلف ۱/۰ تا ۵/۱ میلی گرم به صورت کووالانسی روی مقدار ثابت (۱/۰ میلی گرم (گرافن اکسید فعال شده، تثبیت گردید و در نهایت نسبت بهینه مقدار آنزیم آلفا آمیلاز به گرافن اکسید بر اساس راندمان تثبیت و مقدار فعالیت آنزیم انتخاب شد .نتایج این مرحله نشان داد که بهترین نسبت آنزیم به بستر ۲/۱ میلی گرم آنزیم آلفا آمیلاز به ازای ۱/۰ میلی گرم گرافن اکسید دارای راندمان تثبیت ۰۸/۹۶ درصد و ۴۷/ ۶۲ درصد فعالیت می باشد .در مراحل بعدی این نسبت بهینه از آنزیم و گرافن اکسید با محلول سدیم آلژینات مخلوط و بعد از تشکیل ژل توسط کلسیم کلرید جهت تغلیظ انجمادی در دمای۲۰ - درجه سانتی گراد منجمد شد و در ادامه در دستگاه خشک کن انجمادی خشک شد .به منظور تعیین اندازه و مرفولوژی از تصاویر SEM استفاده شد .تصاویر SEM مربوط گرافن اکسید به صورت ساختار ورقه ای با سطح وسیع و صاف و لبه های مواج ظاهر شد .همچنین مرفولوژی کرایوژل آلژینات به صورت منافذ بهم پیوسته ای بود که اندازه آنها حدود۲۰۰ - ۱۰۰میکرومتر و ضخامت دیواره های این منافذ در حدود ۱۰ میکرومتر شناسایی شد .از طرفی برای بررسی چگونگی و تایید اتصال آنزیم به بستر از طیف فروسرخIR ) - (FTنمونه ها استفاده شد و با توجه به طیف های فروسرخ بدست آمده، حضور گروه های اکسیژن دار در گرافن اکسید و گروه های آلدهیدی در گرافن اکسید فعال شده و نیز تثبیت موفقیت آمیز آنزیم آلفا آمیلاز روی گرافن اکسید و کامپوزیت کرایوژلی آلژینات تایید شد .همچنین در ادامه اثر درجه حرارت (۲۵ تا ۹۰ سانتی گراد (و pH (۵/۵ تا ۵/۳) بر فعالیت آنزیم آزاد و تثبیت شده روی گرافن اکسید و کامپوزیت کرایوژلی و نیز پایداری ذخیره سازی (۱۰روز ذخیره سازی (و پایداری عملیاتی آنزیم آزاد و تثبیت شده در کامپوزیت کرایوژلی آلژینات مورد بررسی قرار گرفت .نتایج این تحقیق نشان داد که مقدار فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز تثبیت شده روی گرافن اکسید و کامپوزیت کرایوژلی آلژینات در pH های مورد بررسی مشابه بود .همچنین تثبیت آنزیم روی گرافن اکسید توانست فعالیت آنزیم در دمای بالا را نسبت به آنزیم آزاد بهتر حفظ کند و در مورد آنزیم تثبیت شده درکامپوزیت کرایوژلی آلژینات دمای بهینه، ۱۰ درجه سانتی گراد افزایش یافت .همچنین فعالیت نسبی آنزیم تثبیت شده در کامپوزیت کرایوژلی آلژینات بعد از ۱۰ روز ذخیره سازی به ۲۵/۵۳ درصد و بعد از ۶ مرتبه واکنش به ۴۷/۵۰ درصد رسید .طی بررسی پارامتر های سینتیکی، مقادیر Km برای آنزیم آلفا آمیلاز آزاد و تثبیت شده در گرافن اکسید و کامپوزیت کرایوژلی به ترتیب(mg/ml) ۹۴/۶ ،۲۵/۱۴ ، ۷۱ /۱۳ و مقادیر Vmبرای آنزیم آلفاآمیلاز آزاد و تثیبت شده در گرافن اکسید و کامپوزیت کرایوژلی به ترتیب) mol/mg.min) ۶۰/۰، ۵۸/۰ ، ۴۶/۰ بدست آمد
Generally, enzymes are biocatalysts that catalyze chemical reactions in cells and organisms, and are widely used in food processes, bioconversions and biosensors production. Alpha-amylase enzyme is one of the most important enzymes in industrial biotechnology, and its importance is due to the wide application of this enzyme in various industries, especially the production of sweeteners. The enzyme in the free state is sensitive to change of optimum conditions and has a short catalytic life. Immobilization as a solution to this challenge can have a significant role in reducing costs for the use of industrial enzymes, especially alpha amylase. The immobilization of enzyme involves enzyme attachment to the support or incorporating it into a polymer matrix. Among the various supports, the use of nanostructured materials, including graphene oxide, has been emphasized in recent applied researches due to the high surface-to-volume ratio and the optimal pore size. One of the best methods for recycling immobilized enzymes from the reaction mixture and isolating them to reuse is the use of cryogel technique. Cryogel is a porous structure that is obtained by freeze drying s of colloidal solution suspension of gel polymers. Sodium alginate is one of the polymers used to make cryogel. Therefore, the aim of this study is immobilizaion of the alpha-amylase enzyme on the graphene support in the cryogel alginate matrix. For this purpose, first, graphene oxide was synthesized and activated by glutaraldehyde, then the alpha-amylase enzyme was immobilized at various concentrations of 0.1 to 1.5 mg as covalently immobilized on a constant amount (0.1 mg) of activated graphene oxide, and the optimal ratio of alpha-amylase enzyme to graphene oxide was determined based on the immobilizaion efficiency and enzyme activity. The results of this stage showed that the best ratio of enzyme to support is 1.2 mg of alpha-amylase enzyme per 0.1 mg of graphene oxide with efficiency of 96.8 and 62.47 of activity. In the next steps, this optimal ratio of the enzyme and graphene oxide was mixed with sodium alginate solution and after formation the gel by calcium chloride, the mixture was frozen at -20 C and dried in the freeze dryer. SEM images were used to determine size and morphology. The SEM images of graphene oxide appeared in the form of sheet structure with large surface and wavy edges. The morphology of cryogel alginate was also continuous in porosity with size about 100-200 micrometers, and the thickness of the walls of these pores was about 10 micrometers. On the other hand, infrared spectrum (FT-IR) samples were used to verify the connection and confirmation of the enzyme binding to the substrate. According to the infrared spectra, the presence of oxygenated groups in graphene oxide and aldehyde groups in activated graphene oxide as well as the successful stabilization of the -amylase enzyme on graphene oxide and cryogly alginates composite were confirmed. Also, the effect of temperature (25 to 90 C) and pH (5.5 to 3.5) on free and immobilized enzyme activity in graphene oxide and cryogel composite, as well as storage stability (10 days storage) and operational stability free and stabilized enzyme in cryogly alginate composite were studied. The results of this study showed that the amount of activity of -amylase enzyme immobilized on graphene oxide and cryogly composite was similar in the studied pH. Also, activity the immobilized of enzyme on graphene oxide improved at a higher temperature than the free enzyme, and increased the optimum temperature of 10 C for the enzyme immobilized in the cryogly alginate composite. Also, the relative activity of the immobilized enzyme in the cryogly alginate composite after 10 days of storage was 53.25 and after six times the reaction to 50.47 . The results of kinetic parameters evaluation indicated that Km values for free enzyme and immobilized enzyme on graphene oxide and cryogly composites were 6.94, 16.25, 13.71 (mg / ml), and Vm values for free and immobilized enzyme on graphen oxide and cryogenic composite was 0.65, 0.58, and 0.46 (mol /mg.min), respectively
Immobilization of alpha-amylase on graphene oxide in alginate cryogel matrix
بابایی، زینب
Babaie, Zeinab
صوتی خیابانی، محمود، استاد راهنما
همیشه کار، حامد، استاد راهنما
رضایی مکرم، رضا، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
