۲۰۲۳۷پ
per
توصیف عملکردی دو گیرنده‌ی نوری DASH کریپتوکروم ۱ و ۲ در جلبک سبز پرسلولیVolvox carteri
Functional characterization of DASH cryptochrome ۱ and ۲ photoreceptors in multicellular green algae Volvox carteri
/سعید مهدوی
: علوم طبیعی
، ۱۳۹۷
، راشدی
۱۳۱ص
چاپی - الکترونیکی
دکتری
زیست‌شناسی گرایش فیزیولوژی گیاهی
۱۳۹۷/۱۰/۱۲
تبریز
گیرنده‌های نوری پیام‌رسان قادرند به وسیله‌ی کروموفورهای خود، نور را جذب کرده، مسیرهای پیام‌رسانی خاصی را در سلول‌ها به‌راه انداخته و پاسخ مناسب در سلول‌ها ایجاد کنند .در ژنومVolvox ، دو ژن که پروتئین‌هایی متعلق به خانواده‌ی Cryptochrome/Photolyase را به رمز درمی‌آورند، پیش‌گویی شده‌است (VcCryDASH۱ و .VcCryDASH۲) هدف از این پژوهش بررسی تاثیر تیمارهای نوری آبی، قرمز وC- UV، بر تعداد رونوشت ژن‌های VcCryDASH۱ و VcCryDASH۲ در ولوکس، شناسایی توالی دقیق نوکلئوتیدی کدکننده‌ی این دو ژن، مشخص‌کردن موقعیت تکاملی پروتئین‌های مربوطه، در خانواده‌ی پروتئینی کریپتوکروم/فتولیازها، تعیین طیف جذبی و بررسی عملکرد آن‌ها در شرایط in vivo می‌باشد qPCR .نشان داد که در جلبک تحت تیمار ۱ ساعته از نور آبی و قرمز) نسبت به نور سفید) نمونه شاهد (وC) - UVتعداد رونوشت ژن‌های VcCryDASH۱ و VcCryDASH۲ در مرحله‌ی بلوغ گونیدیا بطور معنی‌دار، افزایش می‌یابد و این افزایش در نور آبی بیشتر از نور قرمز است .بررسی کینیتیک فلورسانس کلروفیلa ، مشخص کرد که تیمارهای نوری ۱ ساعته نمی‌تواند منجر به ایجاد شرایط تنش‌زا برای جلبک شود .بنابراین تغییر تعداد رونوشت و بیان دو ژن VcCryDASH۱ و VcCryDASH۲ در تیمار نور آبی و قرمز مرتبط با مسیر سیگنالینگ این نورها می‌باشد .به‌منظور تعیین توالی دقیق کدکننده‌ی این دو ژن، ابتدا توالی پیش‌گویی‌شده‌ی آن‌ها از پایگاه‌های‌داده‌ای استخراج شد .سپس با انجام بررسی‌هایin silico ، توالی دقیق اولین و آخرین اگزون ژن‌ها مشخص و پرایمرهای مخصوص همسانه‌سازی در ناقل بیانی۲TK - pGEXطراحی و مورد استفاده قرار گرفت .با استفاده ازPCR - RTتوالی CDS این دو ژن تکثیر گردید و از این آمپلیکون‌ها با کمک تکنیک‌های مهندسی ژنتیک برای همسانه‌سازی در ناقل۲TK - pGEXاستفاده شد .تعیین‌ترادف بر روی پلاسمیدهای نوترکیب انجام گردید.نتایج تعیین‌ترادف نشان داد که توالی بدست‌آمده از تعیین‌ترادف و توالی موجود در پایگاه‌های داده‌ای کمی با یکدیگر تفاوت دارند که این امر بدلیل عدم پیش‌گویی دقیق مرز اگزون/اینترون در بخش‌هایی از ژن‌های ثبت‌شده در پایگاه‌های داده‌ای می‌باشد .بهینه‌سازی تولید پروتئین نوترکیب در باکتری E. coli در زمان‌های مختلف۱ ،۳ ، ۹ و ۱۸ ساعت القاء با سه میلی‌مولارIPTG ، مورد ارزیابی قرار گرفت .تولید کافی پروتئین، در سویه‌یRosetta ، در C۳۲و زمان القاء بیش از ۳ ساعت بدست آمد .در زمان القاء ۱ و ۳ ساعت، نیمی از پروتئین VcCryDASH۱ و کل پروتئین VcCryDASH۲ به‌صورت نامحلول بودند .تخلیص پروتئین فیوژنVcCryDASH۱ - GSTبا استفاده از روش کروماتوگرافی‌تمایلی به‌خوبی انجام گردید اما پروتئینVcCryDASH۲ - GSTدر فاز نامحلول حضور داشت به‌همین‌دلیل شرایط جدید تخلیص این پروتئین تعیین و تخلیص آن نیز بطور مناسب انجام گردید .صحت فرآیند خالص‌سازی، با استفاده از روشPAGE - SDSبررسی شد .برای تعیین طیف جذبی پروتئین‌ها آنالیز طیف‌سنجی با استفاده از پروتئین خالص‌شده انجام شد .مشاهده‌ی قابلیت جذب در طول‌موج‌های۴۰۰- nm۶۰۰، حضور کروموفورهای جاذب نور آبی را در پروتئین‌های مربوطه تایید کرد .به منظور بررسی عملکرد این دو پروتئین در شرایطin vivo ، باکتری‌های E. coli دارای پروتئینGST ،VcCryDASH۱ - GSTوVcCryDASH۲- GST، تحت تابشUV - Cقرار داده شدند .مشاهده شد که حضور پروتئین‌های VcCryDASH۱ یا VcCryDASH۲ باعث افزایش قدرت بقاء باکتری می‌شود .به‌منظور تعیین موقعیت تکاملی VcCryDASH۱ و VcCryDASH۲ ترسیم درخت فیلوژنتیک انجام شد .دیده شد که این پروتئین‌ها متعلق به گروه کریپتوکروم‌های DASH هستند .تعیین دمین‌های تشکیل‌دهنده‌ی این دو پروتئین نشان داد که آن‌ها دارای بخش PHR (Photolyase Homology Region) هستندPHR .، از دمین‌های alpha/beta domain (N ترمینال (وBinding domain (C - FADترمینال (تشکیل می‌شود، که عملکردی مشابه کریپتوکروم /فتولیازها را به این دو پروتئین می‌دهند .همردیف‌سازی پروتئین‌های VcCryDASH۱ و VcCryDASH۲ مشخص نمود که در این دو پروتئین آمینواسیدهای حفاظت‌شده‌ی دارای قابلیت برهمکنش با DNA حضور دارند .این مشاهدات تایید کرد که پروتئین‌های VcCryDASH۱ وVcCryDASH۲ ، دارای توانایی اتصال به DNA می‌باشند و افزایش قدرت بقاء باکتری‌های دارای این دو پروتئین در برابر نورC- UV، بدلیل عملکرد آن‌ها در ترمیم DNA آسیب دیده است .در طی این پژوهش توالی دقیق کدکننده‌ی این دو ژن گزارش گردید .همچنین شرایط مناسب تخلیص پروتئین‌های نوترکیب برای انجام پروژه‌های پایین‌دستی، تعیین طیف‌جذبی پروتئین‌های تخلیص‌شده و بررسی عملکرد in vivo این دو پروتئین پیش‌گویی‌شده با موفقیت انجام شد
Signaling photoreceptors can absorb light by using their chromophores to trigger the specific signaling pathways and establish the proper responses in the cells. In the genome of Volvox, there are two predicted genes which encode the Cyptochrome/Photolyase protein family members. The goals of current research, were to determine the level of VcCryDASH1 and VcCryDASH2 gene transcripts in Volvox under blue, red and UV-C light treatments, to identify their exact encoding nucleotide sequences, in order to reveal their evolutionary positions in the Cyptochrome/Photolyase protein family and to survey their in vivo functions. qPCR analysis showed that the level of VcCryDASH1 and VcCryDASH2 transcripts significantly increased under 1 hour treatments of the blue and red lights (compare to white (as control) and UV-C) during the gonidia maturation of Volvox life cycle and it was higher in blue, rather than red light. Chlorophyll- a kinetic fluorescence investigation revealed that 1-hour light treatments could not cause the stress condition in Volvox. Therefore, the increased levels of the VcCryDASH1 and VcCryDASH2 transcripts and gene expressions under blue and red light treatments are dependent to blue and red light signaling pathways. In order to the amplification of the VcCryDASH1 and VcCryDASH2 coding sequences using PCR, their predicted sequences were obtained from databases. In silico analysis was performed to determine the exact coding sequences of the proteins. Then, the specific primers designed to do the cloning process using the expression vector pGEX-2TK, were used in PCR. Afterward, these amplicons were used in cloning process. The recombinant plasmids were sequenced. The sequencing results showed that there are different between the gained fragments of sequencing and the sequences recorded in databases. These different are caused by incorrect prediction of exon/intron boundary in some parts of the genes. The optimization of recombinant protein production was studies under 1, 3, 9 and 18 hours incubation using 3 mmol of IPTG. Adequate protein production obtaind in 32 0C under more than 3 hours induction. Our results showed insolublity of VcCryDASH2 and half of the VcCryDASH1 proteins under 1 and 3 hours inductions. Purification of the recombinant protein GST-VcCryDASH1 was properly done through affinity chromatography method but the GST-VcCryDASH2 was insoluble. So, the new condition of the protein purification was identified and the purification directed, properly. The accuracy of the purification process was examined by using SDS-PAGE. Spectroscopic analysis directed to identify the spectral absorbtion of the proteins using the purified proteins. The observation of the absorbing capability in 400-600 nm, approved the presence of blue light absorbing chromophores in desired proteins. In order to examine the function of these proteins, the transgenic E. coli with GST, GST-VcCryDASH1 and GST-VcCryDASH2 were exposed to UV-C irradiation. It was observed that the presence of the VcCryDASH1 or VcCryDASH2 proteins, icreased the survival in bacteria. phylogenetic tree drawed to determine the eveloutionaly locations of the VcCryDASH1 or VcCryDASH2 proteins. It was determined that the desired proteins are located in the cryptochrome DASH subclude. Determination of the protein domains revealed that the desired proteins have PHR (Photolyase Homology Region) portion. PHR contains the alpha/beta domain (in N-terminal) and FAD-binding domain (in C-terminal), giving the similar function of the cryptochrome/photolyase to these two proteins. The VcCryDASH1 and VcCryDASH2 protein alignments demonstred that in these proteins, there are conserved amino acids with DNA binding ability. These observations confirmed that VcCryDASH1 and VcCryDASH2 proteins have DNA binding ability and the increase survival of the bacteria against UV-C directed by the function VcCryDASH1 and VcCryDASH2 proteins in DNA repair process. In this research work, we reported the exact coding sequences of VcCryDASH1 and VcCryDASH2 genes and the optimal condition to purify the recombinant proteins in order to apply in down- stream studies. Also, the identification of spectral absorntion of purified proteins and the investigation of in vivo fuctions of these two predicted proteins were directed, successfully
Functional characterization of DASH cryptochrome ۱ and ۲ photoreceptors in multicellular green algae Volvox carteri
مهدوی، سعید
Mahdavi, Saeed
رازقی، سعید، استاد راهنما
کیانیان مومنی، آرش، استاد راهنما
موافقی، علی، استاد راهنما
پژوهنده، مقصود، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
