عنوان

فیزیولوژی سیستم ایمنی، هماتولوژی و کالبدگشایی بره های نر و میزبان اصلی در چالش با آنتی‌ژن حفاظتی اکینوکوکوس گرانولوزوس

‭۱۸۶۰۴پ‬

per

فیزیولوژی سیستم ایمنی، هماتولوژی و کالبدگشایی بره های نر و میزبان اصلی در چالش با آنتی‌ژن حفاظتی اکینوکوکوس گرانولوزوس

/محمد مصطفی پورسیف

: کشاورزی

، ‮‭۱۳۹۶‬

، میرزائی

چاپی

دکترا

علوم دامی گرایش فیزیولوژی دام

‮‭۱۳۹۶/۱۱/۱۶‬

تبریز

انگل اکینوکوکوس گرانولوزوس از جمله شایع‌صترین میکروب‌صهای انگلی است که عامل بیماری کیست هیداتیک در واحدهای دامپروری و در میان جمعیت‌صهای انسانی به ویژه در مناطق روستایی و حومه شهرها است .میزبان‌صهای طبیعی این پاتوژن انگلی به طور عمده سگ) به عنوان میزبان اصلی (و گوسفند و انسان) به عنوان میزبان واسط (هستند .تاکنون اقدامات گوناگونی برای کنترل و پیشگیری این بیماری معرفی اجرا شده است که در این میان استفاده از واکسن‌صهای پیشگیرانه راهکاری نو محسوب می‌صشود .هدف از این مطالعه طراحی و تولید واکسنی نوترکیب است که قابلیت پیشگیری این بیماری را در هر دو میزبان داشته باشد .بررسی میزان ایمنی‌صزایی و سطح حفاظت ناشی از این واکسن در گوسفند و سگ به طور همزمان هدف پایانی این مطالعه است .طراحی سازه‌صی واکسن پلی‌صتوپیک برصاساس آنالیزهای ‮‭in silico‬ بوده و سازه ایمونوژنیک طراحی شده به صورت ساب کلون در پلاسمید‮‭۲۲b - pET‬سنتز و به صورت پروتئین نوترکیب در باکتری (‮‭(Escherichia coli BL۲۱(DE۳)‬ بیان گردید .تایید بیان ژن توسط تکنیک‌صهای‮‭PAGE - SDS‬و ایمونوبلاتینگ انجام گرفت .پس از انجام فرآیندهای دیالیز و تخلیص، پروتئین نوترکیب حاصل به صورت زیرجلدی به حیوانات تزریق گردید .آنتی‌صژن حفاظتی) واکسن (طی دو نوبت و با فواصل چهار هفته‌صای انجام گرفت .ادجوانت فروند کامل و سپس ناکامل، به ترتیب در نوبت اول و دوم تزریقات مورد استفاده قرار گرفت .برای بررسی کارآمدی واکسن طراحی شده نمونه‌صهای خون بصورت هفتگی جمع‌صآوری شدند و شمارش افتراقی سلولهای سفید خونی، سنجش سطوح اینترلوکین ‮‭۴‬ و ایمونوگلوبولین‌صهای ‮‭G‬ و ‮‭E‬ اختصاصی هر گونه، انجام گرفت .سنجش‌صهای ایمونولوژیک با استفاده از کیت و تکنیک الایزا انجام گرفت .در پایان نیز کالبدگشایی حیوانات گروه کنترل مثبت و نیز واکسینه شده انجام گرفت و ارگان‌صهای احشایی) کبد و ریه در گوسفند روده در سگ (به صورت ماکروسکوپی و هیستوپاتولوژیک ارزیابی گردید .داده‌صها با توجه به رویه‌صی ‮‭MIXED PROC‬ و با استفاده از نرم افزار ‮‭SAS ۹.۱.۳‬ مورد آنالیز قرار گرفتند .در سگ‌صها و گوسفندان تیمار واکسینه شده با آنتی‌صژن حفاظتی افزایش معنی‌صداری در سطوح‮‭۴- IL‬، ‮‭IgG‬ و ‮‭IgE‬ مشاهده گردید .همچنین کاهش پارامترهای اریتروسیتی ‮‭(PCV‬ و ‮‭Hb)‬ و افزایش معنی‌صدار درصد ائوزینوفیل‌صهای خون محیطی از یافته‌صهای قابل مشاهده‌صی ایمونولوژیک و هماتولوژیک بودند .‮‭(p<۰.۰۱)‬ در مشاهدات ماکروسکوپیک روده‌صی سگ‌صهای تیمار شده با آنتی‌صژن حفاظتی نیز ضمن برجسته بودن واکنشهای ایمونولوژیک سلول‌صهای اپیتلیال روده، اثری از کرم‌صهای اکینوکوک مشاهده نگردید .در مشاهدات ماکروسکوپی و میکروسکوپی کبد و ریه‌صهای گوسفندان تیمار شده با واکسن و کنترل مثبت کاهش معنی‌صداری در تعداد، اندازه و میزان زایایی کیست‌صهای هیداتید مشاهده گردید .‮‭(p<۰.۰۱)‬ نتایج بدست آمده نشان‌صدهنده‌صی سطح بالای ایمنی حفاظتی در اثر واکسن طراحی شده در گوسفند ‮‭(۴۳/۸۵‬ درصد (و سگ‮‭(۹۹/۹۹‬ درصد (بود .در این مطالعه برای اولین بار واکسنی پلی‌صصتوپیک متشکل از اپی‌صتوپ‌صهای سلول‌صهای ‮‭B‬ و ‮‭T‬ کمک‌صکننده‌صی سه آنتی‌صژن مختلف‮‭(EG۹۵‬ ، ‮‭enolase‬ و‮‭۳) -۳- Eg۱۴‬طراحی شده که مراحل مختلف چرخه زندگی انگل را مورد هدف قرار می-دهند .کارایی واکسن همزمان بر روی هر دو میزبان طبیعی انگل) سگ و گوسفند (مورد بررسی قرار گرفته است .تولید چنین واکسنی می‌صتواند نویدبخش مبارزه‌صی سریع‌صتر و کارامدتر بر علیه ا .گرانولوزوس در میان گوسفندصها و سگ‌صها به طور همزمان باشد که این امر همچنین موجب حذف هزینه‌صهای درمانی فراوانی در گله‌صهای دامپروری و نیز جمعیت‌صهای انسانی خواهد شد

100 in dogs, as compared to the positive control group. The ELISA results showed that the total serum IgG, IgE, as well as IL-4 levels, significantly increased after the subcutaneous immunization with the designed vaccine (p<0.01). However, the second vaccination induced much more serum IgG, IgE and IL-4 levels in comparison with the first immunization (p<0.01). The minigene vaccine included B and T-helper epitopes from three different antigens and it showed a high immune-protection, resulting to the induction of the Th2 immune responses; As a result, this multi-valent epitopic vaccine is proposed as an effective vaccine for the immunization both sheep and dogs against E. granulosus infection~ Cystic echinococcosis (CE) is one of the most important zoonotic parasite diseases in the human, livestock, and wildlife worldwide. Development of effective vaccines against CE appears to be the most promising strategy to control this infectious disease. The use of potential livestock and canine vaccines against the larval and adult stage of Echinococcus granulosus life cycle may be the key to the production of powerful vaccines. In this study, we designed and constructed a novel recombinant vaccine which can prevent this infection in both of the intermediate and definitive hosts, simultaneously. The vaccine construct was designed by means of several computational analyses (generally including in silico epitope prediction, molecular docking and structure modeling). The vaccine construct was synthesized and sub-cloned into the pET22-b plasmid. The protein expression host was Escherichia coli strain BL21 (DE3). The protein expression was approved through by SDS-PAGE and Western-blotting methods. Ni2+ affinity chromatography of the His-tagged recombinant protein was performed for the purification of newly expressed proteins. Some hematological (differential complete blood count), immunological (examination the serum level of IgG, IgE, and IL-4) and histopathological examinations were performed to as the validation analysis to verify the vaccine efficiency. Immunization with the minigene vaccine induced the protective immunity up to 85.43 in sheep and

پورسیف، محمد مصطفی

مقدم، غلامعلی، استاد راهنما

امیدی، یداله، استاد راهنما

دقیق کیا، حسین، استاد مشاور

نعمت الهی، احمد، استاد مشاور

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی