۱۸۶۰۲پ
per
همسانه‌سازی ژن NHX۱ به روشPCR -RTاز گیاهSalicornia europaea
/فرید امیری
: کشاورزی
، ۱۳۹۶
، میرزائی
چاپی
کارشناسی ارشد
بیوتکنولوژی کشاورزی
۱۳۹۶/۱۱/۱۶
تبریز
نیازهای تغذیه‌صای جمعیت رو به رشد جوامع، استفاده از خاک و آب‌صهای شور را گریزناپذیر ساخته است و در این راستا معرفی ارقام و واریته‌صهای متحمل به شوری از اولویت‌صهای تحقیقات کشاورزی قرارگرفته است .اغلب گیاهان بجز هالوفیت‌صها قادر به بقا در شرایط شوری نیستند .یکی از راه‌صهای بهبود توانایی گیاهان برای حفظ میزان رشد و بهره‌صوری در شرایط شوری، استفاده از زیست فناوری گیاهی بویژه گیاهان تراریخته است .این رهیافت نیازمند ژن‌صهای درگیر در تحمل به شوری می‌صباشد .ژنهای آنتی‌صپورتر واکوئلی+/H+ Na ، میزان تحمل به شوری و عملکرد را در گیاهان افزایش می‌صدهند .گیاه سالیکورنیا از جمله گیاهان هالوفیتی است که دارای فعالیت مناسبی از پروتئین آنتی‌صپورتر+/H+ Na می‌صباشد و دستیابی به ژن رمزگردان آن در این تحقیق هدف‌صگذاری شد .بدین منظور مطالعات بیوانفورماتیکی ژن هدف انجام و با استفاده از نرم‌صافزارهای Primer Blast و Oligo Analyzer آغازگرهای اختصاصی برای تولید cDNA طراحی و سفارش شد . در این پروژه RNA ی کل به روش ترایزول استخراج و پس از تایید کمی و کیفی آن در الکتروفورز ژل آگارز، از آنزیم ترانس‌صکریپتاز معکوس، آغازگر معکوس و Oligo dT برای سنتز cDNA استفاده شده است .سپس cDNA ی حاصل برای واکنش PCR ص مورد استفاده قرارگرفته و پس از تایید محصول PCR در الکتروفورز ژل آگارز، قطعه‌صی تکثیر شده در پلاسمید خطیpTG۱۹ - Tدرج و در باکتری E.coli سویه DH۵ همسانه‌صسازی گردید .برای تهیه‌صی سلول‌صهای مستعد از روش TSS و برای انجام تراریختی باکتریایی از روش شوک حرارتی استفاده گردید .غربال‌صگری باکتری‌صهای تراریخته به روش آبی- سفید در حضور آنتی‌صبیوتیک آمپی‌صسیلین، IPTG وgal - xانجام شده و صحت تراریختی باکتریایی از طریق کلنی PCR بررسی شد .سپس استخراج پلاسمید انجام گردید و پس از تایید آنزیمی طول قطعه‌صی همسانه‌صسازی شده جهت توالی‌صیابی به شرکت Bioneer ارسال صشد . در مرحله‌صی آخر، با استفاده از نرم‌صافزار BLAST توالی بدست آمده تجزیه و تحلیل شده و انطباق و مشابهت آن با توالی ژنهای ثبت شده در بانک‌صهای نوکلئوتیدی مورد بررسی قرار گرفت .این بررسی‌صها ضمن تایید صحت قطعه همسانه‌صسازی شده، موید این بود که توالی نوکلئوتیدی قطعه کلون شده از اکوتیپ نواحی ساحلی دریاچه ارومیه با توالی مندرج در بانک اطلاعاتی نوکلئوتیدی شباهت ۹۶ درصدی داشت
Nutritional needs of the growing population of communities have inevitably led to the use of saline soil and waters and in this regard introduction of the tolerant cultivars and varieties is the priority of agricultural research. Most plants, except halophytes, cannot survive in salinity conditions. One of the methods in improving the ability of plants to maintain growth and productivity in salinity conditions is to use plant biotechnology, especially transgenic plants. This approach requires genes involved in salinity tolerance. The Na+/H+ vacuolar antiporter genes increase salinity tolerance and improves plant yield. The Salicornia plant is a halophyte plant in which antiporter Na+/H+ protein has appropriate activity, so obtaining its encoder gene was targeted in this research. For this purpose, bioinformatics studies were done on the targeted gene and through Primer Blast and Oligo Analyzer software, specific primers for producing cDNA were designed and ordered. In this project, total RNA was extracted by Tryzol method and after qualitative and quantitative confirmation in Agarose electrophoresis gel; reverse transcriptase enzyme, reverse primer and Oligo dT were used for cDNA synthesis. Then, the resulting cDNA was used for PCR reaction, and after confirmation of the PCR product in the agarose electrophoresis gel, the replicated fragment was inserted into the pTG19-T linear plasmid and cloned into E.coli strain DH5. The TSS method was used to prepare comptent cells and the thermal shock method was used to perform bacterial transformation. Following the screening of transgenic bacteria with white-blue approach in the presence of Ampicillin, IPTG and x-gal, validity of bacterial transfection was investigated through PCR colony. Then, plasmid extraction was performed and after enzymatic confirmation of the length of cloned fragment was sent to Bioneer Corporation for sequencing. In the last step, using the BLAST software, the obtained sequence was analyzed and its adaptation and similarity to registered nucleotide sequence of genes in the nucleotide data banks were investigated. These studies, confirmed the validity of the cloned fragment and they also confirmed that the nucleotide sequences of the cloned fragment from the ecotype of the coastal areas of Urmia Lake are 96 similar to the sequence contained in the nucleotide database
امیری، فرید
باغبان کهنه ورز، بهرام، استاد راهنما
تورچی، محمود، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
