۱۷۷۹۹پ
per
خاموشی ژن‌صهای پلی فنل اکسیداز و گلوکوزیل ترانسفراز آلکالوئید استروئیدی در گیاه سیب‌صزمینی از طریقRNAi
/یوسف محمدی
: کشاورزی
، ۱۳۹۶
، افشاری
چاپی
Improvement of the potato quality has been one of the main objectives of potato breeders. In this regard, the reduction of steroidal glycoalcaloadoids and prevention of enzymatic browning are one of the main goals for improving the quality of this plant. Steroidal glycoalkaloids are toxic compounds with bitter taste and found in the Solanaceae family. Usually, these substances are produced in potato tubers exposed to light or germination, which causes large amounts of poisoning. In addition, the enzymatic browning of the potato is occured during mechanical damage, and this is done by the polyphenol oxidase enzyme (PPO). To reduce the accumulation of glycoalkaloids and to resolve the problem of the enzymatic browning in the tubers, RNAi can be used for silencing of Steroidal Alkaloid Glucosyltransferase (SGT) and polyphenol oxidase genes. In this research, Agria and Marfona cultivars, which are compatible and cultivated in the Iran, were used as plant material. To achieve this goal, the nucleotide sequences of the genes were downloaded from the NCBI database. According to the design required for the RNAi cassette, the fragments of the sgt1, sgt2, sgt3, ppo1, ppo2 and ppo3 genes were artificially synthesized at the antisense direction. Then, the desired fragment was amplified in the sense direction using the specific primers of the antisense portion and integrated into the pGH plasmid. In order to construction RNAi, the antisense-loop-sense fragment was integrated in the pCAMBIA3301 plasmid and the main construct, pCAMBIA-SGT-PPO, was constructed. After confirmation of construct by PCR, coating the tungsten particles with the pCAMBIA-SGT-PPO was done. Also, explants of leaf, petiole, internode of the Marfona and Agria were transformed by gene gun. After shutting, the explants were transferred to the regeneration medium and putative transgenic lines were transferred to the new medium for micropropogation and molecular analysis. For confirmation of pCAMBIA-SGT-PPO transgenic lines, PCR analysis were carried out for the presence of antisense-sense and bar genes. All rooted lines were positive for both fragments and, amplified in lengths of 488 and 297 bp fragment, respectively. The results showed that the Marfona variety was better than the Agria in terms of the number of shoots, the total number of regenerated shoots, the number of rooted shoots and the transgenic efficiency. Marfona was the most suitable variety for the transformation. Real time RT-PCR was used to determine the expression of genes and ubiquitin was used as reference gene. The expression of sgt1, sgt2 and sgt3 in Marfona transgenic lines was about 4.2, 6.1 and 9.9. relative to the control plant. Similar results were observed for Agria variety. The expression of these genes was 5.6, 12.1 and 10. . The results of the analysis of high performance liquid chromatography showed that -solanine and -chaconine had a significant reduction compared of the control, while solanidine was significantly increased. The study of the expression of ppo1, ppo2 and ppo3 genes showed that transgenic lines of Marfona had transcriptional levels of 9.7, 16 and 96.2. relative to the control plant. While for Agria, this results were 10.3, 17 and 97
دکتری
اصلاح نباتات گرایش ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک
۱۳۹۶/۰۶/۱۳
تبریز
بهبود کیفی سیب‌صزمینی از دیرباز جزو اهداف اصلی اصلاح‌صگران بوده است .کاهش گلیکوآلکالوئیدهای استروئیدی و جلوگیری از قهوه‌صای شدن آنزیمی از اهم اهداف در این گیاه به حساب می‌صآید .گلیکوآلکالوئیدهای استروئیدی ترکیبات سمی با مزه تلخ بوده و در خانواده سولاناسه یافت می‌صشوند .معمولا این مواد در غده‌صهای سیب‌صزمینی در معرض نور یا جوانه زنی تولید می‌صشود و مقادیر زیاد آن باعث مسمومیت می‌صگردد .قهوه‌صای شدن آنزیمی در غده سیب‌صزمینی نیز به هنگام صدمات مکانیکی اتفاق می‌صافتد .این عمل به واسطه فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز (PPO)انجام می‌صگیرد .در این تحقق برای کاهش تجمع گلیکوآلکالوئیدها و رفع مشکل قهوه‌صای شدن آنزیمی در غده‌صها از خاموشی ژن‌صهای رمز کننده گلوکوزیل ترانسفراز آلکالوئید استروئیدی (SGT) و ژن‌صهای پلی فنل اکسیداز استفاده شد .ارقام گیاهی آگریا و مارفونا که سازگار و مورد کشت در کشور هستند به عنوان مواد گیاهی انتخاب شد .برای رسیدن به این هدف، ابتدا توالی نوکلئوتیدی ژن‌صهای مورد نظر از بانک اطلاعات NCBI بارگیری و طبق نقشه کاست RNAi مورد نیاز، ابتدا قطعاتی از ژن‌صهایsgt۱ ،sgt۲ ،sgt۳ ،ppo۱ ، ppo۲ و ppo۳ در جهت ناهمسو به صورت مصنوعی سنتز گردید .سپس قطعه مورد نظر در جهت همسو با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی تکثیر و در پلاسمید pGH همسانه سازی گردید .برای ساخت سازه RNAi نهایی، قطعه حاوی ناهمسو همسو در پلاسمید pCAMBIA۳۳۰۱ درج و سازه اصلی با نامPPO -SGT- pCAMBIAساخته شد .پس از اطمینان از صحت سازه حاصله از طریقPCR ، پوشش دار کردن ذرات تنگستن (۱/۱ میکرون (با سازهPPO -SGT- pCAMBIAو بمباران ریزنمونه‌صهای برگ، دمبرگ و میانگره ارقام مارفونا و آگریا توسط تفنگ ژنی ( BioRad, PDS۱۰۰۰/He) صورت گرفت .پس از شلیک، ریز نمونه‌صها به محیط باززایی انتقال و گیاهان تراریخته شده فرضی در محیط گزینش تولید و برای آنالیز مولکولی و ریزازدیادی به محیط ریشه زایی منتقل گردیدند .برای تایید اولیه گیاهان فرضی تراریخته حاصل ازPPO-SGT- pCAMBIA، آزمایشات PCR برای حضور قطعه ناهمسو-همسو و ژن bar صورت گرفت .تمامی نمونه‌صهای ریشه دار شده برای هر دو قطعه مثبت بوده و مطابق با نتیجه مورد انتظار به ترتیب قطعاتی به طول ۴۸۸ و ۲۹۷ جفت باز تکثیر شد .رقم مارفونا از لحاظ تعداد ریزنمونه‌صهای شاخساره‌صده، تعداد کل شاخساره‌صی باززایی شده، تعداد شاخساره‌ص ریشه دار شده و کارایی تراریختی بهتر از رقم آگریا بوده و رقم مناسبی برای تراریخته کردن سیب‌صزمینی می‌صباشد .برای بررسی میزان بیان ژن‌صها ازPCR -Real time RTو برای یکنواخت‌صسازی داده‌صها از ژن یوبی کوئیتین استفاده شد .میزان بیان ژنsgt۱ ، sgt۲ و sgt۳ در لاین‌صهای تراریخته مارفونا به‌صترتیب در حدود۲/۴ ، ۱/۶ و ۹/۹ درصد نسبت به گیاه شاهد بود .برای رقم آگریا نیز نتایج تقریبا مشابهی مشاهده گردید به‌صطوریکه میزان بیان ژن‌صهای مذکور۶/۵ ، ۱/۱۲ و ۱۰ درصد به دست آمد .نتایج آنالیز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نیز نشان داد که میزان آلفا سولانین، آلفا چاکونین نسبت به شاهد کاهش چشمگیری داشته است در حالیکه ماده سولانیدین افزایش چشمگیری داشته است .مطالعه بیان ژن‌صهایppo۱ ، ppo۲ و ppo۳ نشان داد که در لاین‌صهای تراریخته مارفونا، سطوح رونویسی۷/۹ ، ۱۶ و ۲/۹۶ درصد گیاه شاهد بود در حالیکه برای رقم آگریا اعداد۳/۱۰ ، ۱۷ و ۹۷ درصد گیاه شاهد به دست آمد .نتایج نشان داد که سازهPPO -SGT- pCAMBIAکارایی لازم را برای خاموشی ژن‌صهایsgt۱ ،sgt۲ ،sgt۳ ، ppo۱ و ppo۲دارد ولی برای ژن ppo۳ موثر نمی‌صباشد .
Improvement of the potato quality has been one of the main objectives of potato breeders. In this regard, the reduction of steroidal glycoalcaloadoids and prevention of enzymatic browning are one of the main goals for improving the quality of this plant. Steroidal glycoalkaloids are toxic compounds with bitter taste and found in the Solanaceae family. Usually, these substances are produced in potato tubers exposed to light or germination, which causes large amounts of poisoning. In addition, the enzymatic browning of the potato is occured during mechanical damage, and this is done by the polyphenol oxidase enzyme (PPO). To reduce the accumulation of glycoalkaloids and to resolve the problem of the enzymatic browning in the tubers, RNAi can be used for silencing of Steroidal Alkaloid Glucosyltransferase (SGT) and polyphenol oxidase genes. In this research, Agria and Marfona cultivars, which are compatible and cultivated in the Iran, were used as plant material. To achieve this goal, the nucleotide sequences of the genes were downloaded from the NCBI database. According to the design required for the RNAi cassette, the fragments of the sgt1, sgt2, sgt3, ppo1, ppo2 and ppo3 genes were artificially synthesized at the antisense direction. Then, the desired fragment was amplified in the sense direction using the specific primers of the antisense portion and integrated into the pGH plasmid. In order to construction RNAi, the antisense-loop-sense fragment was integrated in the pCAMBIA3301 plasmid and the main construct, pCAMBIA-SGT-PPO, was constructed. After confirmation of construct by PCR, coating the tungsten particles with the pCAMBIA-SGT-PPO was done. Also, explants of leaf, petiole, internode of the Marfona and Agria were transformed by gene gun. After shutting, the explants were transferred to the regeneration medium and putative transgenic lines were transferred to the new medium for micropropogation and molecular analysis. For confirmation of pCAMBIA-SGT-PPO transgenic lines, PCR analysis were carried out for the presence of antisense-sense and bar genes. All rooted lines were positive for both fragments and, amplified in lengths of 488 and 297 bp fragment, respectively. The results showed that the Marfona variety was better than the Agria in terms of the number of shoots, the total number of regenerated shoots, the number of rooted shoots and the transgenic efficiency. Marfona was the most suitable variety for the transformation. Real time RT-PCR was used to determine the expression of genes and ubiquitin was used as reference gene. The expression of sgt1, sgt2 and sgt3 in Marfona transgenic lines was about 4.2, 6.1 and 9.9 relative to the control plant. Similar results were observed for Agria variety. The expression of these genes was 5.6, 12.1 and 10 . The results of the analysis of high performance liquid chromatography showed that -solanine and -chaconine had a significant reduction compared of the control, while solanidine was significantly increased. The study of the expression of ppo1, ppo2 and ppo3 genes showed that transgenic lines of Marfona had transcriptional levels of 9.7, 16 and 96.2 relative to the control plant. While for Agria, this results were 10.3, 17 and 97 of the control plant. The results of present study showed that pCAMBIA-SGT-PPO had the necessary efficacy to silence the sgt1, sgt2, sgt3, ppo1 and ppo2 genes, but not for ppo3 gene
محمدی، یوسف
باغبان کهنه روز، بهرام، استاد راهنما
قلی‌زاده، اشرف، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
