۱۶۸۱۹پ
per
بررسی مقاومت ناشی از ساختار RNA سنجاق سری دوگانه در برابر ویروس برگ بادبزنی مو
/سمیرا پاکباز
: کشاورزی
، ۱۳۹۵
چاپی
دکتری
بیماری‌شناسی گیاهی
۱۳۹۵/۰۶/۰۲
تبریز
ویروس برگ بادبزنی مو (GFLV ، Grapevine fanleaf virus)متعلق به جنس Nepovirus و عامل یکی از شایع‌صترین و مخرب‌صترین بیماری‌صهای ویروسی مو در سراسر دنیا است که تا ۸۰ درصد خسارت می‌صزند و کیفیت و طول عمر مو را در تاکستان‌صها کاهش می‌صدهد .استفاده از ارقام مقاوم گیاهی بهترین راه برای کنترل عوامل ویروسی می‌صباشد .القاء مقاومت به واسطه RNA Silencing یک روش خوب و کارا برای ایجاد ارقام مقاوم به ویروس‌صها می‌صباشد .از طرف دیگر مهار خاموشی ژن می‌صتواند به طور مؤثری توسط مهارکننده‌صهای خاموشی ویروسی (VSRs) که قابلیت سرکوب سیستم خاموشی میزبان و ایجاد آلودگی را دارند، صورت گیرد .مهارکننده‌صهای خاموشی در بیشتر جنس‌صهای ویروسی گیاهی به خوبی توصیف شده‌صاند، اما شناسایی آن‌صها در اعضاء جنس Nepovirus کمتر بررسی شده است و دانش ما از تعیین کننده‌صهای علایم و مهارکننده‌صهای خاموشی در ویروس‌صهای این جنس خیلی محدود است .در این تحقیق جهت تعیین مهارکننده خاموشی درGFLV ، ژن GFP در لاین ۱۶c گیاهان تراریخت Nicotiana benthamiana که بیان کننده پروتئین فلورسنت سبز می‌صباشد، با استفاده از ناقل ویروسیEGFP - pTRVخاموش شد .سپس توانایی هفت پروتئین رمز شده از ژنوم GFLV در مهار خاموشی ژن GFP و به کمک تکنیک بیان موقت ژن در این گیاهان ارزیابی شد .عملکرد این پروتئین‌صها با کنترل‌صهای مثبت و منفی به کاربرده شده در این تحقیق مقایسه گردید .نتایج نشان داد که پروتئین‌صهای رمز شده توسط دو ژن ۱A و۱B ، عملکردی مشابه با کنترل مثبت p۲۴ در مهار خاموشی ژن دارند .سپس با ساخت سازه‌صی حامل توالی کامل نوکلئوتیدی هر دو ژن ۱A و۱B ، توانایی مهارکنندگی خاموشی این دو ژن برای اولین بار در ویروس برگ بادبزنی مو (GFLV) به عنوان یک عضو مهم و اقتصادی از Nepovirus تأیید گردید .جهت بررسی امکان ایجاد مقاومت به GFLV با استفاده از سیستم القاء مقاومت به واسطه RNA از توالی نوکلئوتیدی این دو ژن برای ساخت سازه سنجاق‌صسری استفاده شد که در آن قطعه‌صای از هر ژن به طور جداگانه در جهت سنس و آنتی سنس در دو طرف یک ناحیه اینترونی و در مقابل پیش‌صبر ۳۵SCaMV در پلاسمید pGA۴۸۲G قرار گرفت .این سازه پس از نسخه‌صبرداری حالت سنجاق‌صسری به خود گرفته و القاءکننده مکانیسم خاموشی ژن در گیاه می‌صباشد .جهت تراریختی توتون با این سازه از سیستم آگروباکتریوم استفاده شد .پس از تأیید انتقال ژن به گیاهان با استفاده از آزمونPCR ، گیاهان تراریخت به منظور ارزیابی مقاومت نسبت بهGFLV ، مایه‌صزنی مکانیکی شدند ۱۰ .روز پس از مایه‌صزنی ویروس سه نوع واکنش مقاومت، حساسیت و تأخیر در بروز علایم در گیاهان مایه‌صزنی شده مشاهده شد .آزمون الایزا نیز عدم حضور ویروس را در گیاهان مقاوم تراریخت تأیید کرد .در این گیاهان حتی یک ماه پس از مایه‌صزنی، هیچ‌صگونه علایم ویروسی مشاهده نشد .درحالی که گیاهان تراریختی که حضور ویروس در آن‌صها با آزمون الایزا ردیابی شد، علایم موزاییک را یک هفته پس از مایه‌صزنی و مشابه تیپ وحشی گیاهان مایه‌صزنی شده با GFLV نشان دادند .نتایج این تحقیق نشان داد که سازه۱B + ۱Aبه کار رفته برای القاء مقاومت کارایی بالایی داشته و می‌صتوان از آن برای ایجاد مقاومت در ارقام مختلف مو نسبت به GFLV استفاده کرد
Grapevine fanleaf virus (GFLV) is a member of the genus Nepovirus and one of the most common and destructive viral diseases of grapevines worldwide that causes significant crop losses (80 ) and reduces fruit quality and shortens the longevity of grapevines in the vineyards. The most efficient method to control viruses is the use of resistant plant varieties. The RNA silencing-based resistance is the best way to establish the resistant plants against viruses. However gene silencing can be effectively inhibited by virus-encoded silencing suppressors (VSRs) which surmount host silencing system and allow infection. VSRs are well described in most plant virus genera, but their identification in Nepovirus is pending, and our knowledge of symptom determinants and VSRs of viruses from this genus is very limited. In this study in order to determine silencing suppressor of GFLV, the GFP gene was silenced in GFP-transgenic Nicotiana benthamiana 16c line by pTRV-EGFP and then the ability of the seven encoded proteins from GFLV was evaluated for suppression of gene silencing using Agrobacterium-mediated transient gene expression assay. The efficiency of these proteins was compared with positive and negative controls. The results showed that the efficiency of 1A and 1B genes is very similar to p24, a positive control which suppresses gene silencing. Then a construct including complete nucleotide sequence of 1A and 1B genes was developed and their efficiency in plant was evaluated and the ability of these two genes in suppression of gene silencing was confirmed for the first time in GFLV as an important and economic member of Nepoviruses. In order to investigate the possibility of induction of resistance against GFLV using RNA-mediated induction of resistance, nucleotide sequence of 1A and 1B genes was used to produce a hairpin construct. The construct was developed using intron and also the fragments in sense and antisense directions in front of 35S promoter in pGA482G. This construct will make a hairpin structure after transcription and induce mechanism of gene silencing in plant. A. tumefaciens was used to transform N. benthamiana plants. To evaluate resistance to GFLV after confirmation of transformation by PCR reaction, the transgenic plants were mechanically inoculated with this virus. Ten days after virus inoculation, the inoculated plants showed various reactions including resistance, susceptibility and delay in symptom production. ELISA assay confirmed the absence of virus in resistant transgenic plants. No symptom was observed in these plants even a month after inoculation. The transgenic plants in which the virus was detected by ELISA reaction, mosaic symptom similar to that in wild type plants was appeared one week after inoculation. The results of this study showed that both 1A and 1B genes from GFLV suppress gene silencing and a hairpin construct containing a fragment of 1A+1B is efficient to establish resistance to this virus and it could apply to produce resistance in different varieties of grape
پاکباز، سمیرا
پژوهنده، مقصود، استاد راهنما
گندمانی، امید عینی، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
