عنوان

جداسازی و شناسایی آزوسپیریلوم های مولد اکسین و بررسی اثرات جدایه های برتر بر رشد و ریشه زایی ذرت

‭۱۶۷۹۹پ‬

per

جداسازی و شناسایی آزوسپیریلوم های مولد اکسین و بررسی اثرات جدایه های برتر بر رشد و ریشه زایی ذرت

/شکوفه مرادی

: کشاورزی

، ‮‭۱۳۹۵‬

چاپی

کارشناسی ارشد

علوم خاک

‮‭۱۳۹۵/۰۴/۲۲‬

تبریز

هورمون اکسین در رشد و توسعه گیاه نقش اساسی دارد و بسیاری از باکتری‌صها از جمله باکتری‌صهای آزوسپیریلوم‌ص‍ قادر به تولید آن می‌صباشند .باکتری آزوسپیریلوم یکی از باکتری‌صهای مورد توجه در کودهای زیستی است و قادر است که در افزایش محصول اکثر گیاهان زراعی اثرگذار باشد .در این تحقیق اقدام به جداسازی و شناسایی باکتری‌صهای آزوسپیریلوم از ریشه گیاهان گرامینه شد و تأثیرات آنها بر رشد و ریشه‌صزایی ذرت مورد بررسی قرار گرفت ‮‭۱۷‬ .نمونه‌ص‍ ریزوسفری گیاهان گرامینه از خاک استان‌صهای آذربایجان‌صشرقی، اردبیل و گیلان با کاربری‌صهای مختلف برای جداسازی مورد استفاده قرار گرفتند .پس از ضدعفونی) با اتانول ‮‭۹۶‬ و هیپوکلریت سدیم ( ‮‭۵/۰‬ ریشه‌صهای ظریف و نازک، به خوبی له شدند و با تهیه سری‌صهای رقت، اقدام به کشت و جداسازی اولیه در محیط کشت نیمه جامد ‮‭NFB‬ شد .پس از مشاهده غشاء بالارونده در محیط نیمه جامد، این غشاها به محیط کشت جامد ‮‭NFB‬ منتقل شدند و با بررسی کلنی‌صهای به دست آمده، کلنی‌صهای خالص در محیط ‮‭NFB‬ نیمه‌صجامد مجددا از نظر تشکیل غشاء ارزیابی شدند .خالص‌صسازی نهایی باکتری‌صها در محیط کشت کنگورد صورت گرفت که در آن کلنی‌صها به رنگ صورتی و صورتی متمایل به قرمز بودند .بدین ترتیب ‮‭۷۵‬ جدایه باکتری جداسازی شد که برخی از آنها به دلایلی همچون عدم تشکیل غشای واضح و یا تشکیل غشاهای مشابه حذف شدند و ‮‭۳۶‬ جدایه باقی‌صمانده در ارزیابی کیفی اکسین و همچنین بررسی انحلال کیفی فسفر مورد استفاده قرار گرفتند .جدایه‌صهایی که از این منظر توانایی بهتری از خود نشان دادند برای انجام آزمایشات گلخانه‌صای و بررسی ویژگی‌صهای محرک رشدی مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفتند .در بخش آزمایش درون‌صشیشه‌صای، ویژگی‌صهای محرک رشدی باکتری‌صها همچون تولید اکسین، انحلال فسفات معدنی، آزادسازی پتاسیم و تولید سیدروفور برای ‮‭۲۴‬ جدایه منتخب و دو جدایه‮‭AC۴۶‬ - ‮‭I‬و‮‭۲O - C۱۶‬که به ترتیب متعلق به جنس‌صهای آزوسپیریلوم و سودوموناس بودند، به عنوان کنترل مثبت، ارزیابی شدند .در ارزیابی کیفی تولید اکسین هیچ گونه تغییر رنگی در محیط کشت باکتری مشاهده نشد .در بررسی کمی تولید اکسین، جدایه‮‭Az‬ - ‮‭۳‬بالاترین ‮‭(۲۸/۲‬ میلی‌صگرم بر لیتر (و جدایه‮‭۴۸ - Az‬پایین‌صترین ‮‭(۷۵/۰‬ میلی‌صگرم بر لیتر (مقادیر را به خود اختصاص دادند .در اندازه‌صگیری انحلال فسفات، جدایه‮‭۵۲ - Az‬توانست مقدار فسفر بیشتری ‮‭(۱۲۵/۳۴۰‬ میلی-گرم بر لیتر (را حل کند و در بررسی کیفی انحلال فسفات بالاترین نسبت قطر هاله به قطر کلنی متعلق به جدایه‮‭۵۹ - Az‬بود .در اندازه‌صگیری آزادسازی پتاسیم از کانی‌صهای میکا به غیر از جدایه‌صهای‮‭۲۱- Az‬،‮‭۵۹ - Az‬و‮‭۶۵ - Az‬سایر جدایه‌صها با شاهد در یک گروه آماری قرار گرفتند و اختلاف آماری معنی‌صداری نداشتند .هیچ یک از جدایه‌صها توانایی تولید سیدروفور در محیط ‮‭CAS‬ آگار را نداشت .برای کشت گلخانه‌صای، ‮‭۲۴‬ جدایه‮‭۳- (Az‬،‮‭۶- Az‬،‮‭۸- Az‬،‮‭۱۱- Az‬،‮‭۱۲- Az‬،‮‭۱۳- Az‬،‮‭۱۵- Az‬،‮‭۱۸- Az‬،‮‭۱۹- Az‬،‮‭۲۰- Az‬،‮‭۲۱- Az‬،‮‭۲۹- Az‬،‮‭۳۱- Az‬،‮‭۳۷- Az‬،‮‭۴۸- Az‬،‮‭۵۰- Az‬،‮‭۵۲- Az‬،‮‭۵۹- Az‬،‮‭۶۳- Az‬،‮‭۶۵- Az‬،‮‭۶۸- Az‬،‮‭۷۰- Az‬،‮‭۷۱- Az‬،‮‭۷۳) - Az‬مورد استفاده قرار گرفتند .آزمایش گلخانه‌صای به صورت طرح کاملا تصادفی و با در نظر گرفتن ‮‭۳‬ تکرار انجام شد .زادمایه باکتریایی در حامل باگاس و پرلیت تهیه و برای تلقیح بذور ضدعفونی شده ذرت استفاده شد .بذرهای تلقیح شده در گلدان‌صهای یک کیلوگرمی و در بستری از شن استریل کشت شدند .آبیاری با استفاده آب مقطر استریل و عناصر غذایی مورد نیاز با محلول هوگلند در طول مدت رشد تأمین شد .آزمایش تا مرحله رشد رویشی ذرت) دو ماه (پیش رفت و پس از آن پارامترهای گیاهی پیش از برداشت از جمله شاخص کلروفیل، قطر ساقه و ارتفاع گیاه و پارامترهای پس از برداشت از قبیل حجم ریشه، وزن تر و خشک ریشه، وزن تر و خشک بخش هوایی، وزن تر و خشک کل همچنین مقدار و غلظت عناصر غذایی موجود در عصاره‌صهای گیاهی) پتاسیم، فسفر، نیتروژن، آهن و روی (اندازه‌صگیری شد .نتایج آزمایش حاکی از آن بود که بیشترین حجم ریشه به مقدار ‮‭۶۷/۴۷‬ و ‮‭۶۷/۳۸‬ سانتی‌صمتر مکعب در تیمارهای تلقیح‌صشده با جدایه‌صهای‮‭۱۳ - Az‬و‮‭۷۳ -Az‬به‌ص‍ دست آمد، در حالی که بیشترین وزن خشک ریشه در تیمارهای تلقیح‌صشده با جدایه‮‭Az‬- ‮‭۸‬مشاهده شد .تیمار تلقیح‌صشده با جدایه‮‭۴۸ - Az‬بیشترین وزن خشک کل را در بین تیمارها به خود اختصاص داد .آنالیز عناصر گیاهی در بافت خشک گیاه نشان داد که تیمار تلقیح‌صشده با جدایه‮‭۴۸ - Az‬با مقادیر‮‭۶۶/۸۰‬ ،‮‭۸۵/۱۰‬ ، ‮‭۲/۲۴۱‬ و ‮‭۶۷/۴‬ میلی‌گرم بر گلدان به‌ص‍ ترتیب بیشترین مقادیر عناصر نیتروژن، فسفر، پتاسیم و آهن را جذب نموده صاست و بیشترین مقدار روی جذب شده متعلق به تیمار تلقیح شده با‮‭۲۱ - Az‬بود .در پایان به منظور شناسایی جدایه‌صهایی که از لحاظ خصوصیات محرک رشدی و همچنین افزایش در پارامترهای رشد گیاهی در مقایسه با سایر جدایه‌صها مقادیر بهتر و بالاتری به خود اختصاص دادند، از روش مولکولی مبتنی بر ‮‭(۱۶S rDNA)‬ و جهت شناسایی تکمیلی از آزمون‌صهای بیوشیمیایی استفاده شد .نتایج توالی‌صیابی جدایه‌صها مشخص ساخت که جدایه‮‭Az‬ - ‮‭۳‬متعلق به جنس‮‭Acinetobacter‬،‮‭۸- Az‬،‮‭۱۹ - Az‬و‮‭۵۰ - Az‬متعلق به جنس‮‭Pseudomonas‬ ،‮‭۱۸ - Az‬متعلق به جنس‮‭Rhizobium‬ ،‮‭۴۸ - Az‬متعلق به جنس ‮‭Enterobacter‬و‮‭۶۳ - Az‬متعلق به جنس ‮‭Advenella‬بود .به‌صدلیل عدم مشاهده باکتری آزوسپیریلوم در بین باکتری‌صهای شناسایی شده، ضرورت دارد که توجه بیشتری به شناسایی کامل و دقیق جدایه‌صها شود

Az-73) in a completely randomized design withthree replications. Bacterial inoculants were prepared in the carrierof bagasse and perlite. In order to test the bacterial produced auxin in root development, inoculated seeds of corn were planted in the sterile sand. Pots were irrigated by sterile distilled water and all nutrients were added to the pots via Hogland solution. Experiment continued to 2 months and some parameters such as (chlorophyll index, diameter of stem and plant height) and others (including root volume, fresh and dry weight of shoot, fresh and dry weight of root and the concentration and content of nutrients in plant tissues) were measured before and after of harvesting the plant, respectively. Maximum volume of roots were observed in the isoltaes Az-13 and Az-73 by the volume of 47.67 and 38.67 cm3, respectively. Whereas Az-8 had the highest root dry matter. Maximum total dry weight was gained by isolate Az-48. Nutrition analysis in dry tissue of corn showed that Az-48 had highest uptake of nitrogen, phosphorus, potassium and iron with the value of 80.66, 10.85, 241.2 and 4.67 mg/pot and greatest of the zinc absorbed with Az-21. Finally, molecular and biochemical identification was carried out andthe results revealedthat Az-8, Az-19 and Az-50 belonged to the Pseudomonas genus, Az-3 belonged to the Acinetobacter genus, Az-18 belonged to the Rhizobium genus, while Az-48 identified as Enterobactersp. and Az-63 belonged to the Advenella genus. Because we coldnt identify any Azospirilla among the isolated bacteria in this research, it is recommended that identification of thes bacteria will take more concern in the future studies ،Az-71 ،Az-70 ،Az-68 ،Az-65 ،Az-63 ،Az-59 ،Az-52 ،Az-50 ،Az-48 ،Az-37 ،Az-31 ،Az-29 ،Az-21 ،Az-20 ،Az-19 ،Az-18 ،Az-15 ،Az-13 ،Az-12 ،Az-11 ،Az-8 ،Az-6 ،Auxin plays a key role in plant growth and development. Many bacteria such as Azospirilla are able to produce this hormone. Azospirillum bacteria is considered in formulation of biofertilizers as an efficient bacteria in increasing the yield of most crops. In this study, isolation and identification of Azospirillum bacteria was performedin root samples of grasses and its inoculation effect on corn growth and root development was evaluated. Seventeen rhizosphere soil samples of grasses from East Azarbaijan, Ardabil and Gilan provinces were used for this study. After disinfection of root sampes byethanol and sodium hypochlorite (0.5 ), roots were crushed and serial dilutions were prepared to transfer an aliqute of microbial suspension to the semisolid NFB medium. Isolation process of Azospirilla was followed after observing the rising pellicle and transferring that to solid NFB medium. Once more, pure colonies of bacteria in this medium were checked and assessed forrising pellicle formation in semi-solid medium NFB. Final purification of the bacteria werecompleted in congo red (CR) medium. However, 75 bacterail isolates in primary screening were decreased to 36 isolates after ignoring the bacteria with similar phenotypes or bacteria with not-sharp pellicles. These bacteria were used for auxin production or phosphate solubility tests in a qualitative manner and efficient isolates were selected for in-vitro experiments and pot culture.In-vitro tests incliuding evaluation of auxin production, phosphate solubility, potassium releasing ability and siderophore productionwere done for 24 selected isolates along with the isolates AC46-I and C16-2O (belonged toAzospirillum sp. and Pseudomonas sp., respectively) as positive controls. Although, in qualitative evaluating of auxin productionwas not observedany color change (pink color) in the bacterial medium butin the quantitative analysis, the highest amount of auxin was measured with Az-3 (2.28mg/l) and lowest amount was measured with Az-48 (0.75 mg/l). Highest phosphate solubility was measured when the isolate Az-52 (340.12 mg/l) inoculated in liquid Pikovskaya medium while highest phosphate solubilization index or highest ratio of HD/CDbelonged to Az-59 in solid Pikovskaya medium. In assessing of the potassium release, isolates did not have significant differences with the un-inoculated control apart from the isolat Az-21, Az-59 and Az-65. None of the isolates had the ability to produce a siderophore in CAS agar medium. Pot culture was conducted by inoculation of corn seeds with 24 bacterial isolates (Az-3

مرادی، شکوفه

ساریخانی، محمدرضا، استاد راهنما

علی اصغر زاد، ناصر، استاد مشاور

سیاه و سفید

نمایه‌سازی قبلی