۱۴۳۷۸پ
per
مقایسه مهار فعالیت آنزیم‌های پروتئاز و آلفا-آمیلاز گوارشی سوسک کلرادوی سیب‌زمینی (Leptinotarsa decemlineata Say) توسط عصاره پروتئینی برخی بذور گیاهی در شرایط in vitroو in vivo
/شبنم عاشوری
: کشاورزی
، ۱۳۹۴
چاپی
دکتری
حشره‌شناسی کشاورزی با گرایش سم‌شناسی و فیزیولوژی حشرات
۱۳۹۴/۰۹/۳۰
تبریز
حفظ تمامیت سامانه گوارشی حشرات به دلیل اهمیت آن در کسب غذا بسیار مهم می‌صباشد، در غیر این صورت چرخه زندگی حشرات مختل خواهد گردید .ایجاد اختلال در فعالیت آنزیم‌صهای گوارشی حشرات آفت توسط مهارکننده‌صهای موجود در بافت‌صهای گیاهی مورد تغذیه که بخشی از سامانه دفاعی گیاه می‌صباشند، یکی از روش‌صهای کنترل آفات محسوب می‌صشود .بنابراین، هدف از این تحقیق، شناسایی برخی ویژگی‌صهای بیوشیمیایی آنزیم‌صهای آلفا-آمیلاز و پروتئاز گوارشی سوسک کلرادوی سیب‌صزمینی (Leptinotarsa decemlineata Say) در شرایط مختلف آزمایشی، شناسایی مهارکننده‌صهایی با درجه اختصاصیت مختلف از برخی بذور گیاهی علیه فعالیت این آنزیم‌صها، بررسی مهار فعالیت آنزیم‌صها با استفاده از زایموگرام، مطالعه کینتیک مهار و تعیین نوع مهار فعالیت آنزیم‌صها، بررسی اثرات این مهارکننده‌صها روی برخی مولفه‌صهای زیستی لاروها در شرایط تغذیه‌صای همراه با اثر ارقام مختلف سیب‌صزمینی روی آن‌صها، مقایسه الگوی پروتئینی روده حشرات تغذیه نموده از مهارکننده‌صها و خالص‌صسازی مهارکننده موثر با روش‌صهای مختلف کروماتوگرافی می‌صباشد .در آزمایش‌صهای مقدماتی، شرایط بهینه برای فعالیت آلفا-آمیلاز و پروتئازهای گوارشی لارو سن چهار سوسک کلرادوی سیب‌صزمینی به دست آمد و فعالیت آلفا-آمیلاز و پروتئاز تام در سنین مختلف لاروی و حشرات کامل، در شرایط مختلف پرورشی و گرسنگی مورد مقایسه قرار گرفت .تهیه عصاره پروتئینی با استفاده از روش رسوب‌صدهی پروتئین با سولفات آمونیوم انجام شد .عصاره پروتئینی بذور آفتابگردان روی فعالیت پروتئاز تام و عصاره‌صهای پروتئینی بذور تریتیکاله، لوبیا سفید، گندم، چاودار، لوبیا قرمز، لوبیا چیتی و جو روی فعالیت آلفا-آمیلاز اثر مهارکنندگی بیش‌صتری داشتند .با وجود این، عصاره پروتئینی بذور کلزا فعالیت هر دو آنزیم را به صورت معنی‌صداری مهار کرد .بیش‌صترین میزان مهارکنندگی عصاره‌صها در اسیدیته‌صهای ۵ و ۶ به دست آمد .از بین فرکشن‌صهای۰- ۳۰،۳۰- ۵۰،۵۰ - ۷۰و۷۰ - ۱۰۰اشباع با سولفات آمونیوم، سه فرکشن اول عصاره‌صهای آفتابگردان و کلزا روی فعالیت پروتئاز، از طرفی فرکشن دوم عصاره کلزا، فرکشن‌صهای اول و دوم عصاره‌صهای جو، گندم و تریتیکاله و هر چهار فرکشن عصاره‌صهای چاودار، لوبیا چیتی، لوبیا سفید و لوبیا قرمز روی فعالیت آلفا-آمیلاز لارو سن چهار میزان مهار بیش‌صتری را سبب شدند .هم‌صچنین همه فرکشن‌صهای ذکر شده روی فعالیت آنزیم‌صهای تمامی سنین لاروی و حشره کامل دارای خواص مهارکنندگی بودند .در زایموگرام آلفا-آمیلاز دو آیزوزیم و در زایموگرام پروتئاز تعداد زیادی آیزوزیم مشاهده شد که در حضور غلظت یکسان از مهارکننده‌صها، نوارهای آنزیمی یا کاملا حذف شدند و یا شدت نوارها یعنی شدت فعالیت آنزیمی کاهش یافت .در آزمایش‌صهای کینتیک مهاری، نوع مهار فعالیت پروتئاز با عصاره آفتابگردان و کلزا، به ترتیب غیررقابتی و رقابتی تعیین شد .نوع مهار فعالیت آلفا-آمیلاز نیز، توسط عصاره‌صهای جو، چاودار و گندم چندگانه و توسط عصاره‌صهای تریتیکاله، کلزا، لوبیا چیتی، لوبیا سفید و لوبیا قرمز نارقابتی تعیین گردید .در تمامی آزمایش‌صها، فعالیت آنزیم‌صها به صفر نرسید و مهار جزئی بود .براساس ثابت مهاری، روی فعالیت آلفا-آمیلاز قدرت مهاری عصاره بذور تریتیکاله از همه بیش‌صتر و عصاره بذور کلزا از همه کم‌صتر، همچنین روی فعالیت پروتئاز قدرت مهاری عصاره بذور آفتابگردان بیش‌صتر از کلزا بود .در زیست‌صسنجی‌صها، با استفاده از ارقام آگریا، بورن، پیکاسو و مارکز سیب‌صزمینی، عصاره‌صهای جو، چاودار، کلزا، لوبیا قرمز و تریتیکاله در زمان پوست اندازی لاروهای سن سه به چهار، وزن لاروهای سن چهار و درصد لاروهای سن چهار تشکیل شده، تاثیر سوئی داشتند .بیش‌صترین میزان تاثیر عصاره‌صها در مولفه‌صهای رشدی لاروها روی ارقام پیکاسو و مارکز مشاهده شد .رقم پیکاسو حساس‌صترین و رقم بورن مقاوم‌صترین ارقام به سوسک کلرادوی سیب‌صزمینی بودند .در نهایت، در فعالیت آلفا-آمیلاز لاروهای سن چهار، توسط عصاره لوبیا قرمز در تمامی ارقام مورد مطالعه، کاهش معنی‌صدار رخ داد .الگوی پروتئینی روده لاروها در شاهد و تیمار عصاره پروتئینی بذور لوبیا قرمز توسط الکتروفورز دو بعدی مورد مقایسه قرار گرفت و تغییر در الگوی پروتئینی روده به شکل تغییر در لکه‌صهای پروتئینی تیمار نسبت به شاهد مشاهده شد .در خالص‌صسازی مهارکننده کلزا با کروماتوگرافی تعویض یونی دو فرکشن از چهار فرکشن حاوی دو نوار پروتئینی آنیونی با وزن مولکولی به ترتیب ۳۴ و ۳۲ کیلودالتون و ۱۶ و ۱۵ کیلودالتون به دست آمدند و فرکشن به دست آمده با کروماتوگرافی تمایلی با ماتریکس دی اکسید سیلیکون نیز حاوی دو نوار پروتئینی ۲۴ و ۲۲ کیلودالتونی بود .در خالص-سازی مهارکننده آفتابگردان توسط کروماتوگرافی تعویض یونی از بین چهار فرکشن به دست آمده، فرکشن اول حاوی دو نوار خالص‌صسازی شده پروتئین کاتیونی با وزن مولکولی ۱۵ و ۱۴ کیلودالتون و تک فرکشن به دست آمده با کروماتوگرافی تمایلی با ماتریکس دی اکسید سیلیکون نیز حاوی دو نوار مشابه با همان وزن مولکولی بودند .هر دو روش در خالص‌صسازی پروتئین مهارکننده سیستئین پروتئاز سوسک کلرادو از عصاره‌صهای کلزا و آفتابگردان روش‌صهای موفقی بودند .درحالی‌صکه در کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و تمایلی با ماتریکس کیتوزان با وجود مقادیر بالای خالص-سازی و بازده، اما چون در ژل نوار خالص پروتئینی مشاهده نشد، روش‌صهای مناسبی برای خالص‌صسازی مهارکننده از عصاره کلزا نبودند .با شناسائی توالی اسیدهای‌صآمینه پروتئین‌صهای مهارکننده در این گیاهان و انتقال ژن‌صهای مرتبط با این پروتئین‌صها به گیاه سیب‌صزمینی می‌صتوان این گیاه را در مقابل آسیب سوسک کلرادوی سیب‌صزمینی، مقاوم نمود
The integrity of insects digestive tract has to be ensured at all costs, because it is their main food entry way, otherwise, their life cycles may be interrupted. Disrupting the activity of digestive enzymes of pests by inhibitors in host plant tissues, which are part of the plant defense system, is one of the pest control methods. So, the aim of current research was to identify some of the biochemical properties of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) digestive alpha-amylase and proteases in the different experimental conditions, to identify various inhibitors from some plant seeds with different degree of specificity on these enzymes, to investigate the inhibition of enzymes using zymogram, to study the inhibitory kinetics and determine the type of enzymes inhibition, to investigate the effects of this inhibitors on some biological parameters of larvae under the feeding conditions combined with the effect of different cultivars of potato on them, to compare the gut protein pattern of insects that feed from inhibitors and purification of effective inhibitors by various chromatographic methods.In the primary experiments, the optimal conditions for the activity of fourth instar larvae digestive alpha-amylase and proteases were obtained, and the activities of digestive alpha-amylase and general protease were compared at different larval stages and adults, also at different rearing conditions and starvation.Preparation of protein extracts was performed using ammonium sulfate precipitation. Sunflower seed protein extract had inhibitory effect on protease activity, and seed protein extracts of triticale, white beans, wheat, rye, red beans, pinto beans and barley inhibited alpha-amylase activity. However, protein extract of rapeseed inhibited both enzyme activities, significantly. The maximum inhibitory effects of extracts were seen at pHs 5 and 6.Between the fractions 0-30, 30-50, 50-70 and 70-100 saturation with ammonium sulfate; three first fractions of sunflower seed and rapeseed caused the most inhibition on fourth instar larval protease activity. Second fraction of rapeseed; first and second fractions of barley, wheat and triticale and every four fractions of rye, pinto beans, white beans and red beans caused high inhibition on fourth instar larval alpha-amylase activity. Furthermore, all mentioned fractions had inhibitory properties on all the related enzyme activities of whole larval stages and adults.In the alpha-amylase zymogram, two isozymes and in the protease zymogram a large number of isozymes were observed. In the presence of the same concentration of inhibitors, enzymatic bands were disappeared completely, or the intensity of them (enzyme activity) was decreased sharply.In the kinetics experiments, the type of protease inhibition by seed protein extract of sunflower and rapeseed was non-competitive and competitive, respectively. The type of alpha-amylase inhibition by seed protein extract of barley, rye and wheat was mixed, and by seed protein extract of triticale, rapeseed, pinto beans, white beans and red beans was determined uncompetitive. In all experiments, the activity of the enzymes was not zero, so called partial inhibition. According to the inhibition constant, on the alpha-amylase activity, triticale and rapeseed extracts had the greatest and lowest inhibitory effects respectively; also on the protease activity, the inhibitory effect of sunflower seed extract was higher than rapeseed extract.In bioassays using different cultivars of potato; Agria, Burren, Picasso and Marx, seed protein extracts of barley, rye, rapeseed, red beans and triticale had significant effects on duration of molting from third to fourth instar larvae, weight of fourth instar larvae and percentage of fourth instar larval evaluation. The highest effects of extracts on larval growth parameters were seen on Picasso and Marx. Picasso and Burren were the most sensitive and resistant cultivars to the Colorado potato beetle, respectively. Finally, the activity of fourth instar larval alpha-amylase decline occurred in all cultivars by red beans seed protein extract.The gut protein patterns of larvae in the control and treatment of red beans seed protein extracts were analyzed by two-dimensional electrophoresis. The gut protein pattern was changed as different protein spots in the treatment compared to the control.In the purification of rapeseed inhibitor by ion exchange chromatography, two fractions of obtained four fractions, contained two anionic protein bands with molecular weights 34 and 32 kDa; 16 and 15 kDa, respectively and protein fraction obtained by affinity chromatography with silicon dioxide matrix also contained two protein bands with molecular weights 22 and 24 kDa. In the purification of sunflower seed inhibitor by ion exchange chromatography between the obtained four fractions, first one contained two cationic protein bands with molecular weights 15 and 14 kDa, and fraction obtained by affinity chromatography with a matrix of silicon dioxide also contained similar two bands with the same molecular weights. Both techniques were successful in the purification of Colorado potato beetle cysteine protease inhibitor from rapeseed and sunflower seed protein extracts. However, gel filtration and affinity chromatography with a matrix of chitosan were not appropriate inhibitor purification methods from rapeseed extract; despite high levels of the purification folds and yields, because the purified protein band(s) were not observed on the gel.By identifying the amino acid sequence associated with the inhibitor proteins and transferring these proteins to the potato, can make resistant plant against the Colorado potato beetle damage
عاشوری، شبنم
فرشباف پورآباد، رضا، استاد راهنما
بندانی، علی رضا، استاد مشاور
سیاه و سفید
نمایه‌سازی قبلی
